Журнал «Клеточные технологии в биологии и медицине», 2011, №4, с.196-199

И.Б.Соколова, Е.Г.Гилерович, Н.Н.Павличенко, Д.Г.Полынцев

ООО “Транс-Технологии”, Санкт-Петербург

Проведен морфологический анализ структуры гиппокампа головного мозга крыс после удаления двигательной коры левого полушария. Сформированы четыре экспериментальные группы животных: две контрольные, животным которых внутривенно и инрацеребрально вводили среду культивирования, и две группы клеточной терапии, которым подобным образом трансплантировали МСК. Через 10 нед у животных контрольных групп во всех зонах гиппокампа были выявлены нарушения цитоархитектоники и большое количество погибших нейронов. В группах клеточной терапии патологических изменений в структуре гиппокампа не обнаружено: гиперхромных нейронов не было, клетки имели правильную форму и тесно прилегали друг к другу.

Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, удаление двигательной коры, гиппокамп

В 1970-е годы в гиппокампе крыс были выявлены особые клетки, электрическая активность которых повышалась при попадании животного в незнакомое место. Эти клетки получили название “place cells” [9]. Была выдвинута гипотеза о том, что основной функцией гиппокампа являются обработка и хранение информации об окружающем пространстве, ориентация, выбор путей передвижения и др. Предположили, что гиппокамп играет роль своеобразной когнитивной карты, отражающей представление животного об окружающей обстановке и его местонахождении. Позже клетки с подобными свойствами были обнаружены и в гиппокампе человека [6]. Place cells диффузно распределены во всех зонах гиппокампа: в СА1 и СА3 — это пирамидальные клетки, в зубчатой извилине — зернистые клетки. Повреждение гиппокампа отрицательно влияет на когнитивное и ориентировочно-исследовательское поведение как у животных, так и у человека: резко ухудшается краткосрочная память, затрудняются процесс обучения, ориентация во времени и пространстве [5]. На разных экспериментальных моделях черепно-мозговой травмы было показано, что морфологические изменения в гиппокампе наблюдали не только при непосредственном механическом повреждении этой структуры или пограничных с ней областей головного мозга, но и в тех случаях, когда травматический очаг находился на значительном удалении [1]. 

Цель данного исследования — выяснить, какие морфологические изменения в гиппокампе происходят у крыс в течение 10 нед после удаления двигательной коры (УДК) левого полушария и какое влияние оказывает внутривенная и интацеребральная трансплантация МСК на состояние гиппокампа. 

Методика исследования

Эксперименты проведены на половозрелых крысах-самцах Вистар—Киото (n=40) массой 200-250 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище. Исследования проводили в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных целей (Страсбург, 1986). Протокол экспериментов был одобрен этическим комитетом.

Двигательную кору левого полушария головного мозга удаляли следующим образом. Крыс наркотизировали 30 мкл золетила (Золетил 100, “Virbac Sante Animale”) интраперитонеально. С помощью бормашины в теменной кости черепа левого полушария высверливали отверстие площадью 2×3 мм, удаляли твердую мозговую оболочку и всю двигательную кору (АР=(-1)-(-4) мм от брегмы; SD=1.0 мм латерально от сагиттального шва). Глубина повреждения не превышала 2 мм. Кожную рану на голове ушивали.

МСК из КМ крыс выделяли по стандартной методике [2].

Фенотипирование МСК крыс проводили методом проточной цитофлюориметрии на проточном цитофлюориметре “Epics XL” (“Beckman Coulter”). Культура МСК состояла на 97% из CD90+-клеток, среди которых около 15% были CD106+, и на 3% из CD45+-клеток (клетки гематопоэтического ряда).

Были сформированы четыре группы животных. В 1-ю группу (контроль I; n=10) вошли животные, которым после УДК в хвостовую вену вводили 100 мкл культуральной среды, во 2-ю (клеточная терапия I; n=10) — крысы, которым непосредственно после УДК в хвостовую вену вводили 5 млн МСК в 100 мкл культуральной среды, в 3-ю (контроль II; n=10) — животные, которым после УДК интрацеребрально вводили 20 мкл культуральной среды, и в 4-ю (клеточная терапия II; n=10) — крысы, которым после УДК интрацеребрально вводили 200 000 МСК в 20 мкл культуральной среды.

Интрацеребральную трансплантацию проводили посредством двух уколов по 10 мкл культуральной среды или клеточной суспензии в область мозга, пограничную с поврежденной фронтально и дорсально на глубину не более 2 мм (т.е. только в неокортекс).

Эвтаназию животных проводили через 2 и 10 нед после УДК. Крыс декапитировали, извлекали головной мозг, вырезали фрагмент, включавший место повреждения и краевые зоны. Мозг фиксировали в Zn-формалине в течение 1 сут, обезвоживали в спиртах повышающейся концентрации, готовили парафиновые блоки, а затем срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали толуидиновым синим по методу Ниссля.

Анализ структур гиппокампа проводили на уровне -1.14 мм от брегмы. 

Результаты исследования

УДК левого полушария проводили так, что повреждение локализовалось в неокортексе, не затрагивая внешнюю капсулу. Механического повреждения гиппокампа ни при УДК, ни при трансплантации в мозг МСК не происходило.

Через 2 нед после УДК при морфологическом анализе препаратов головного мозга животных 1-й группы (контроль I) в зоне СА1 и зубчатой извилине выявлено большое количество нейронов, поврежденных по гиперхромному типу. Цитоархитектоника слоев была нарушена, в зубчатой извилине наблюдался мощный отек. Во 2-й группе (клеточная терапия I) как в СА1, так и в зубчатой извилине, гиперхромных клеток практически не наблюдалось, нейроны имели правильную форму и плотно прилегали друг к другу. В 3-й группе (контроль II) в зоне СА1 было очень много гиперхромных нейронов. Цитоархитектоника была значительно нарушена (выявлены участки без нейронов). В зубчатой извилине отмечены отдельные гиперхромные клетки. Сильного отека не наблюдалось.В 4-й группе (клеточная терапия II) в СА1 гиперхромных клеток было мало, но расстояние между нейронами увеличено. Изменений в морфологическом строении зубчатой извилины не выявлено.

Через 10 нед у животных 1-й группы (контроль I) все зоны гиппокампа имели нарушение в строении (выявлены целые участки, лишенные клеток). В СА1 и зубчатой извилине было очень много нейронов, гибнущих по гиперхромному типу. Меньшие морфологические повреждения в структуре гиппокампа наблюдались во 2-й группе животных (клеточная терапия I): здесь в СА1 и зубчатой извилине выявлены только единичные погибшие нейроны, цитоархитектоника зон практически не была изменена. В 3-й группе (контроль II) было очень много погибших нейронов как в СА1, так и в зубчатой извилине. Архитектоника слоев была нарушена. В то же время у животных из 4-й группы (клеточная терапия II) патологических изменений в структуре гиппокампа не выявлено: гиперхромных клеток не было, нейроны имели правильную форму и тесно прилегали друг к другу.

Таким образом, результаты исследования свидетельствовали о том, что УДК негативно влияло на морфологическое состояние всех зон гиппокампа: в течение 10 нед наблюдалась прогрессивная гибель нейронов в СА1 и зубчатой извилине. Внутривенная или интрацеребральная трансплантация МСК привела к тому, что гибель нейронов уже в первые недели после травмы была выражена значительно меньше, а к 10-й неделе практически все клетки гиппокампа находились в морфологически неповрежденном состоянии, имели обычную форму и образовывали плотные слои. Следовательно, трансплантация МСК оказывает протекторное воздействие не только на нейроны пограничной с повреждением зоны, как ранее было показано на примерах ишемического инсульта и минимальной травмы сенсомоторной коры головного мозга [10], но и на нервные клетки структур мозга, удаленных от места повреждения.

Выявлен ряд трофических факторов, оказывающих нейропротекторное влияние посредством связывания свободных радикалов, понижения апоптотической активности и ускорения течения воспалительной реакции: GDNF, BDNF, NGF, EGF и bFGF [7]. Эти же вещества МСК секретируют in vitro и, вероятно, могут вырабатывать их в ткани травмированного мозга, ингибируя апоптоз и повышая жизнеспособность поврежденных клеток [4].

Кроме того, гиппокамп — это одна из структур, в которой в мозге взрослых животных имеет место нейрогенез [8]. Ранее нами было продемонстрировано, что трансплантация МСК активировала нейрогенез в субвентрикулярной зоне боковых желудочков после ишемического инсульта [10]. Можно предположить, что стимулирующее воздействие МСК отражается и в гиппокампе и погибшие в результате УДК нейроны зубчатой извилины в какой-то мере могут быть заменены вновь образованными.

Сохранение структуры гиппокампа после травмы головного мозга имеет огромное значение для поддержания когнитивного и ориентировочно-исследовательского поведения на уровне интактных животных. Нами было показано с помощью теста “открытое поле” (данные не представлены), что УДК левого полушария через 10 нед приводило к уменьшению количества основных поведенческих актов в 2-4 раза. Животные становились заторможенными, не исследовали установку, долго принимали решение о начале перемещения и бoльшую часть времени находились без движения. Трансплантация МСК в хвостовую вену привела к тому, что за первые 2 нед животные уменьшили свою двигательную и исследовательскую активность в 1.5-2 раза, но в дальнейшем сохранили данный уровень поведения. Интрацеребральная трансплантация МСК позволила с первых недель предотвратить нарушение в поведении животных после УДК, и через 10 нед они имели такое же количество всех двигательных актов, как и интактные.

Литература

1. Белошицкий В. // Нейронауки: теоретичнi та клiнiчнi аспекти. 2005. Т. 1, № 1. С. 81+87.

2. Соколова И., Зинькова Н., Билибина А. и др. // Клет. трансплантол. и ткан. инженер. 2007. Т. 2, № 4. С. 54+62.

3. Соколова И., Федотова О., Гилерович Е. и др. // Клет. трансплантол. и ткан. инженер. 2009. Т. 4, № 4. С. 1+8.

4. Chen L., Tredget E., Wu P., Wu Y. // PloS One. 2008. № 3. P 1+3.

5. Clark R., Zola S., Sguire L. // J. Neurosci. 2000. Vol. 20, N 23. P. 8853+8860.

6. Ekstrom A.D., Kahana M.J., Caplan J.B. et al. // Natura. 2003. Vol. 425. P. 184+188.

7. Hirouchi M., Ukai Y. // Nippon Yakurigaku Zasshi. 2002. Vol. 120, N 2. P. 107+113.

8. Lu D., Qu C., Goussev A. et al. // J. Neurotrauma. 2007. Vol. 24, N 7. P. 1132+1146.

9. O′Keefe J., Dostrovsky J. // Brain Res. 1971. Vol. 34, N 1. P. 171+175.

10. Pavlichenko N., Sokolova I., Vijde S. et al. // Brain Research. 2008. № 1233. P 203+213.