Статьи

03 октября 2012

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СПОСОБОВ ЭКСТРАКЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Журнал"Лаборатория"№4,2012,с.14-15

к.б.н. Ведерников В.Е. (Лаборатория молекулярной диагностики ООО "Вега" ГК "Алкор Био") 

ВВЕДЕНИЕ

Чувствительность полимеразной цепной реакции (ПЦР)  в значительной степени зависит от эффективности выделения ДНК из клинического материала. Недостаток информации об особенностях различных методов пробоподготовки и отсутствие четких утвержденных требований к характеристикам наборов для экстракции нуклеиновых кислот (НК)  может привести к затруднениям при выборе методики для решения конкретной задачи.

В настоящее время на территории России для диагностики наследственных и инфекционных заболеваний широко используется метод ПЦР. Одним из ключевых моментов эффективной молекулярно-генетической диагностики является этап пробоподготовки. Соблюдение выработанных годами клинико-диагностической практики требований к каждой процедуре этого этапа крайне необходимо для получения достоверных результатов. Чувствительность метода ПЦР в значительной степени зависит от эффективности выделения ДНК из клинического материала. На данный момент наиболее востребованными в клинической практике методами экстракции ДНК являются: сорбционный метод, метод на основе спиртового осаждения и экспресс-метод экстракции ДНК. Каждый из перечисленных подходов имеет свои достоинства и недостатки. К сожалению, выбор того или иного метода пробоподготовки основан, прежде всего, на таких его характеристиках, как стоимость, продолжительность и трудоемкость анализа, а не на соответствии выбранной методики поставленной задаче. Это связано с отсутствием доступной аналитической информации в этой области и четких утвержденных рекомендаций по пробоподготовке.

В данной статье мы дадим сравнительную характеристику наиболее применяемых подходов к экстракции НК, а также расскажем о принципах их работы и своих разработках в области пробоподготовки.

Экспресс экстракция на основе температурного лизиса – методика, позволяющая в кратчайшие сроки получить пригодный для постановки ПЦР-анализа препарат НК.

Принцип метода: Клинический образец помещается в пробирку с лизирующим буфером, затем подвергается термической обработке, в процессе которой происходит деструкция клеточных мембран, вирусных оболочек и других биополимерных комплексов и высвобождение НК. С помощью последующего центрифугирования нерастворимые компоненты осаждаются на дне пробирки, а надосадочная жидкость (супернатант), содержащая ДНК, используется для проведения ПЦР.

В настоящее время экспресс-методика выделения ДНК получила широкое распространение. Встречаются данные о том, что экспресс-метод успешно применяется для выделения ДНК таких возбудителей, как Mycobacterium tuberculosis [1], Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium и других инфекций передающихся половым путем (ИППП). В то же время при оценке эффективности выделения ДНК HPV (папилломавирус человека) из соскобов со слизистой урогенитального тракта пациентов с использованием сорбционного и экспресс-метода отмечалось значительное увеличение эффективности в случае выделения сорбционным методом [2]. Это связано с тем, что в процессе пробоподготовки экспресс методом не производится очищение препарата НК от посторонних примесей и концентрирования в малом объеме, что, в совокупности приводит к значительному снижению чувствительности анализа. Так, при экстракции НК из 100 мкл урогенетального соскоба на стадии добавления образца к лизирующему буферу происходит разбавление исходного материала в 4-6 раз без последующей стадии концентрирования.

Чувствительность. С учетом перечисленных фактов, экспресс-методика уступает по чувствительности в 8-12 раз методикам на основе спиртового осаждения и сорбции на силике.

Применение. В большей степени данная методика подходит для молекулярно-генетических исследований, когда требуется лишь качественный анализ, а не определение наличия целевой последовательности инфекционного агента с максимальной чувствительностью.

Образцы. Для проведения анализа подходят образцы только с низким содержанием ингибиторов, такие как урогенетальные соскобы, мазки, слюна и др. 

Спиртовое осаждение – широко распространенная методика пробоподготовки, в основе которой лежит агрегация НК в присутствие соли и спирта.

Принцип метода. После осаждения спиртом НК отделяется от раствора центрифугированием. Осадок, содержащий целевую НК, отмывается 70% этиловым спиртом с последующим центрифугированием. После удаления супернатанта осадок подсушивается и растворяется в водном буфере. Роль соли в протоколе экстракции состоит в том, что её положительно заряженные ионы нейтрализуют отрицательный заряд на сахаро-фосфатном скелете НК, приводя к снижению растворимости последних в воде. В водном растворе электростатическое притяжение положительно заряженных ионов и отрицательно заряженных фосфатных групп подчиняется закону Кулона и зависит от диэлектрической константы раствора. Вода имеет большую диэлектрическую константу, что затрудняет взаимодействие ионов, тогда как этанол с гораздо более низкой диэлектрической константой способствует взаимодействию положительно заряженного иона и фосфатной группы, что приводит к выпадению НК в осадок. Нужно отметить, что НК менее растворима в изопропаноле, чем в этаноле, соответственно для ее осаждения требуются меньшая концентрации изопропанола (для выпадения НК в осадок достаточно присутствия 35 % изопропанола и 0,5 М соли, в то время как этанола требуется около 75% при той же концентрации соли). Таким образом, к образцу изопропанола необходимо добавлять 0,7-1 объема образца, а этанола 2,-2,5 объема. Следовательно, изопропанол предпочтительнее использовать, если есть ограничения по объему используемого пластика (например, есть возможность добавить только один объем образца). В ряде протоколов экстракции предлагается проводить осаждение (преципитацию) НК при пониженной температуре (-20°С). Однако, есть исследователи не согласные с этой теорией; по результатам их экспериментов температура инкубации со спиртом не имеет значительного влияния на выход продукта. Главенствующая роль, по их мнению, должна быть отведена продолжительности центрифугирования [3].

При выделении малых количеств НК (менее 100 нг) для визуализации осадка и улучшения процесса преципитации рекомендуется использовать соосадители, такие как гликоген, линейный полиакриломид или декстран [4]. В некоторых протоколах экстракции предлагается добавлять соосадители непосредственно к осадителю (этанолу или изопропанолу) [5]. Делать этого, однако, не следует, так как соосадитель, попадая непосредственно в спирт, начинает образовывать центры нуклеации в отсутствие НК и, соответственно, при последующем смешивании с образцом в меньшей степени способствует агрегации НК. Соосадитель, таким образом, следует добавлять непосредственно в лизирующий буфер или к образцу.

На предпоследнем этапе выделения ДНК проводится добавление 70% этанола для отмывки осадка от остатков солей. Важно, чтобы отмывка проводилась именно водным раствором спирта, так как соли хорошо растворяются в воде и в гораздо меньшей степени в спирте. Кроме того, использование 70% этанола препятствует переходу НК в водную фазу.

На завершающем этапе процедуры происходит растворение НК в водном буфере обычно при температуре 56-65°С и вортексировании, что необходимо для лучшего растворения осадка.

Объем анализируемого образца 200-500 мкл.

Применение. Данная методика подходит как для молекулярно-генетических исследований, так и для диагностики инфекционных заболеваний. Однако, в силу продолжительности и сложности анализа метод спиртового осаждения получил наибольшее распространение в исследовательских молекулярно-генетических лабораториях и в судебно-медецинских лабораториях, где требуется выделение аналитических количеств ДНК.

Образцы. Для проведения процедуры можно использовать широкий спектр биологических обрзцов, однако при проведении анализа важно учитывать, что спиртовое осаждение приводит к преципитации не только НК, но и белков, что в свою очередь затрудняет получение чистого препарата НК из образцов с высоким содержанием белков, таких как биоптаты или цельная кровь. Наиболее простым путем решения проблемы с нежелательными примесями является уменьшение объема анализируемого образца, однако такой подход не применим, если необходимо получить результат с максимальной чувствительностью.

 

Сорбционная экстракция – методика, в основе которой лежит избирательная сорбция на поверхности силики в присутствие хаотропной соли. Ингибиторы и другие компоненты клинического материала остаются в растворе. С помощью центрифугирования силика с НК осаждается, а супернатант c ингибиторами ПЦР удаляется. Серия последующих отмывок обеспечивает получение высокоочищенного препарата НК.

Принцип метода. Как и во всех процедурах экстракции НК на первом этапе проводится лизис биологического образца. Чаще всего для лизиса используются хаотропные агенты, например гуанидин тиоцианат, которые дестабилизируют водородные связи, ван-дер-ваальсовы и гидрофобные взаимодействия. В таких условиях растворимость НК в воде снижается, а белки денатурируют. Кроме хаотропных солей в лизирующем буфере чаще всего присутствуют детергенты, которые способствуют растворению и лизису белков.

Хаотропная соль необходима не только для лизиса, но и для процесса сорбции НК. Также для усиления процесса сорбции в некоторых протоколах рекомендуют добавлять спирт [6]. Нужно отметить, что сорбция ДНК на силике под действием хаотропных солей – процесс, который по-прежнему вызывает много споров. Однако среди всех существующих точек зрения на процесс взаимодействия ДНК с силикой можно выделить несколько основных.

Первая точка зрения [7] состоит в том, что сорбция ДНК на силике происходит за счёт образования катионных мостиков между силанольными группами, расположенными на поверхности силики и фосфатными группами ДНК. Известно, что в растворе при рН 6 – 8 поверхность силики отрицательно заряжена, как и фосфатные группы НК. Из-за электростатического отталкивания взаимодействие между ними невозможно. Однако при добавлении хаотропной соли отрицательный заряд экранируется. В таких условиях молекулы НК сорбируются на поверхности силики за счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий.

Вторая точка зрения опирается на свойства хаотропных агентов [8]. Известно, что молекула НК в растворе покрыта гидратной оболочкой. Попадая в раствор, молекулы хаотропной соли активно разрушают водородные связи, присоединяя к себе воду. В итоге молекула ДНК, лишённая своей гидратной оболочки, становится гидрофобной. То же самое происходит с поверхностью силики. В итоге между ДНК и силикой возникают гидрофобные взаимодействия, и идёт процесс сорбции.

Согласно еще одной точке зрения [9,10] основным механизм взаимодействия ДНК и силики является образование водородных связей между водой и молекулами НК. Подобные выводы были сделаны после выявления зависимости между количеством адсорбированной ДНК и диаметром пор силики. Предполагается, что сорбция происходит за счет взаимодействия гидратных оболочек образованных поверхностью поры и молекул НК. Авторы подчеркивают, что НК лишь частично включается в поры, а основная часть молекул торчит на поверхности. В данной теории не ясным остаётся роль хаотропных солей, присутствующих в растворе. Вследствие этого наиболее вероятными вариантами механизма сорбции представляются первые два, которые являются взаимодополняющими.

Необходимо также отметить, что процесс сорбции лучше всего идет при высокой ионной силе раствора, показателях рН 3,5-6,5 (оптимум рН 5) и температуре выше 37 °С [11].

После завершения этапа лизиса/сорбции производится центрифугирование, при этом силика вместе с НК образует осадок. Супернатант, содержащий примеси, удаляется, осадок силики/НК, содержащий остаточные количества солей и белков, сначала промывается раствором хаотропной соли, затем от одного до трех раз 70% этиловым спиртом. Спиртовые отмывки необходимы для полного удаления остатков хаотропной соли.

На завершающем этапе процедуры выделения (элюции) в условиях низкой ионной силы раствора происходит высвобождение НК с поверхности силики. Большое значение здесь имеет рН раствора – ДНК лучше элюируется и сохраняет свою целостность при рН 8-9, в то время как для РНК предпочтительнее рН 6-7.

Объем анализируемого образца. Метод сорбции позволяет эффективно выделять НК как из стандартных объемов клинического материала (например, 100 мкл урогенитального соскоба), так и из больших объемов биопроб – от 1 мл и более, при этом не требуется дополнительных стадий концентрирования биологического материала.

Применение. Данный метод подходит как для молекулярно-генетических исследований, так и для обнаружения различных инфекций с максимальной чувствительностью.

Образцы. Метод сорбции на силике позволяет качественно отмывать образец от всевозможных примесей, ингибиторов, которые могут привести к ухудшению реакции. Благодаря этому, данная методика является универсальной – она подходит для любых типов биопроб. 

РАЗРАБОТКИ  КОМПАНИИ АЛКОР БИО

На данный момент в компании Алкор Био разрабатываются наборы для пробоподготовки на основе всех трех подходов к экстракции НК:

1.      Набор для экспресс-выделения нуклеиновой кислоты на основе температурного лизиса, в состав которого введен дополнительный компонент – соосадитель ингибиторов, повышающий качество очистки образца в процессе центрифугирования. Данная разработка находится на стадии экспериментального макета.

2.      Набор на основе спиртового осаждения  находится на стадии регистрации в Федеральной службе по надзору в сфере здравоохранения и социального развития. Эту надежную, проверенную, хорошо работающую методику, нашедшую широкое применение в клинической практике мы адаптировали для выделения геномной ДНК из сухих пятен крови, которые широко используются при проведении скрининга новорожденных.

3.      Набор для выделения нуклеиновых кислот методом магнитоуправляемой сорбции на силике - наиболее интересная и перспективная разработка Принципиальным отличием от классического протокола здесь является то, что в качестве сорбента используются магнитные частички, покрытые силикой. Это дает очень важное преимущество: промывать осадок можно без использования центрифуги, с использованием только магнитного штатива. Данный метод позволяет работать без дорогостоящего оборудования, а для проведения процедуры экстракции НК таким способом требуется значительно меньше времени, чем при использовании других методик. Важным преимуществом магнитоуправляемого выделения является возможность автоматизации процесса. Компания Алкор Био (совместно с нашими партнерами) разработала собственные магнитные частицы, которые отличаются высоким качеством покрытия  и соответствуют лучшим зарубежным аналогам. Эти частицы выращиваются и затем определенным образом покрываются оболочкой силики, на которую в дальнейшем сорбируются НК. Данная разработка проходит аттестацию и планируется к выпуску.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из основных этапов проведения молекулярно-генетических исследований, основанных на методе ПЦР, является выделение ДНК. От выбранного метода выделения зависит чувствительность анализа и как следствие надежность и достоверность получаемых результатов.

Наиболее распространенным методом выделения ДНК в клинико-диагностических лабораториях для диагностики инфекций является экспресс экстракция. Это в первую очередь обусловлено низкой стоимостью анализа и простотой его исполнения. Однако, чувствительность данного подхода в ряде случаев недостаточна для применения с целью диагностики ИППП, что в свою очередь обуславливает долю ложноотрицательных результатов.

Метод спиртового осаждения, обладая высокой чувствительностью, не получил широкого распространения для диагностики ИППП в связи со сложностью и продолжительностью анализа. Тем не менее, этот метод является незаменимым для выделения аналитических количеств ДНК.

Универсальным подходом выделения ДНК является сорбционная экстракция, которая, наряду с высокой чувствительностью, характеризуется простотой исполнения. Более того, использование данного метода выделения НК позволит автоматизировать процесс, что особенно актуально для клинико-диагностических лабораторий с большим потоком исследований. Использование магнитных частиц собственного производства снижает стоимость анализа, что, как мы надеемся, будет способствовать широкому распространению этого наиболее эффективного и качественного метода выделения НК.  

1.                  Киншт В. Н., Воронина Е. Н., Филипенко М. Л. URL: http://www.lytech.ru/data/file/dnk8.pdf (дата обращения: 28.05.2012).

2.                  Зыкова Т.А., Варегина И.З., URL: http://diama.ru/materials/d0231.html (дата обращения: 28.05.2012).

3.                  Zeugin JA, Hartley JL (). "Ethanol Precipitation of DNA". Focus -1985. -Vol. 7(4). -P. 1–2.

4.                  Gaillard С. and Strauss F. // Nucleic Acids Research -1990. -Vol. 18(1). -Р. 378.

5.                  Manual ArchivePure DNA Purification URL: http://www.5prime.com/media/3365/archivepure%20dna%20purification%20kit%20manual_5prime_1044345_032007.pdf (дата обращения: 28.05.2012).

6.                  Manual Dyanabeads SILANE viral NA URL: https://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/370.11D%20Dynabeads%20SILANE%20viral%20NA%20(rev%20001).pdf (дата обращения: 28.05.2012).

7.                  Rother D., Sen T., East D., Bruce I.J. // Nanomedicine (Lond). -2011. -Vol. 6(2). -P. 281-300.

8.                  Mason P. E. [et al.] // J. PNAS -2003. -Vol. 100(8). -P. 4557–4561.

9.                  Fujiwara M., Yamamoto F., Okamoto K., Shiokawa K., Nomura R. // Anal. Chem. -2005. -Vol. 77(24). -P. 8138-8145.

10.              Li X., Zhang J., Gu H. // Langmuir -2011. -Vol. 27(10). -P. 6099-6106.11.              Melzac K. A., Sherwood C. S., Turner R. F. B., Haynes C. A.// J. of colloid and interface science -1996. -Vol. 181. -P. 635–644.