Лобачевская Татьяна Владимировна, к.м.н., доцент, кафедра Клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины, Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П. Павлова, г. Санкт-Петербург

Печальнова Софья Андреевна, врач клинической лабораторной диагностики, Клинико-диагностическая лаборатория «Глобус Мед». г. Санкт-Петербург

Несмотря на значительное количество экспериментальных данных о роли эстрадиола в работе различных органов и систем организма, клиническое применение определения уровня этого гормона долгое время было ограничено. В первую очередь, в связи с недостаточным развитием тест-систем, которые не охватывали весь диапазон возможных значений. В то же время метод, являющийся в настоящий момент референсным для определения эстрадиола - масс-спектрометрия с изотопным разведением, требует значительных затрат на оборудование лаборатории, специального обучения для персонала, вследствие чего не является широко распространенным и доступным для пациентов. Современные методы, основанные на принципах ИФА и ИХЛА, являются промежуточным звеном между устаревшими методиками и «золотым стандартом», и доступны для применения в клинической практике.

Цель: Проверить соответствие возможностей набора «СтероидИФА-эстрадиол» компании «Алкор Био» требованиям задач, которые стоят перед врачом-клиницистом.

Задачи:

1)   Оценить аналитические характеристики набора «СтероидИФА-эстрадиол» компании «Алкор Био».

2)   Провести сравнение набора «СтероидИФА-эстрадиол» компании «Алкор Био» с аналогичными, широко применяемыми на практике тест-системами других производителей.

3)   Оценить набор «СтероидИФА-эстрадиол» компании «Алкор Био» с точки зрения доступности и удобства использования для лабораторий/специалистов.

Материалы и методы:

В группу исследования было включено 40 человек: 6 мужчин и 34 женщины от 22 до 58 лет (средний возраст составил 36 лет). Без соматической патологии в острой стадии. У женщин взятие крови проводилось на 3-5 (фолликулиновая фаза) и 21-23 (лютеиновая фаза) д.м.ц. Также исследовались сыворотки женщин в менопаузе.

В течение 4 часов после взятия кровь центрифугировали, полученные образцы сыворотки хранили до момента исследования в течение 14 дней при температуре -20C.

Определение содержания эстрадиола в сыворотке проводили методом иммуноферментного анализа с использованием наборов «СтероидИФА-эстрадиол», Алкор Био, Россия, «Эстрадиол ИФА», DRG International, Inc, Германия, методом иммунохемилюминисцентного анализа «Access Estradiol (Е2)», Access2, Beckman Coulter, США и «Эстрадиол–Е2 (Estradiol II)», Cobas, Roche Diagnostics, Швейцария.

Для сравнения данных, полученных при помощи указанных тест-систем, применяли корреляционный анализ Пирсона.

Введение

Эстрадиол – половой С-18-стероидный гормон с молекулярной массой 272,4 Да.

Эстрадиол является наиболее активным эндогенным эстрогеном. Основными источниками циркулирующего в крови эстрадиола у женщин детородного возраста являются яичники (в период беременности преимущественно плацента) и, в меньшей степени, кора надпочечников. В мужском организме, а также у женщин в постменопаузе и детей практически весь объем эстрогенов, определяющихся в крови, синтезируется корой надпочечников. Кроме того, небольшие количества этого гормона синтезируются в целом ряде органов: молочных железах, мозге, мышцах, костной и жировой тканях, где эстроген действует местно, как паракринный или интракринный фактор [15].

Эффекты эстрогена осуществляются через специфический внутриклеточный рецептор, имеющий четыре тканеспецифических подтипа (ERa, ERb, GPR30 и ER-X), активируя транскрипцию определенных генов. А также напрямую, через воздействие на выработку простагландинов и гистамина, в частности, по такому механизму реализуется усиление кровотока в матке во время беременности [11, 15].

Наиболее изученными являются эффекты эстрадиола в развитии и функционировании репродуктивной системы. Под его влиянием эмбрион развивается по женскому типу, формируются матка, маточные трубы, влагалище, строма и протоки молочных желез. В пубертате под действием возрастающей концентрации эстрогенов формируются вторичные половые признаки, запускается цикл роста и отторжения эндометрия. У мужчин эстрадиол участвует в сперматогенезе [12, 18]. Определение уровня эстрадиола является важной частью обследования при нарушениях полового развития, менструального цикла, аменорее, бесплодии, признаках феминизации у мужчин.

Однако, современные представления о роли эстрогенов гораздо шире. Доказана роль эстрадиола в метаболизме костной ткани: в формировании и развитии скелета, закрытии зон роста, поддержании нормальной плотности кости. Дефицит эстрогенов (в постменопаузе, ятрогенный) является доказанным фактором риска развития остеопороза.

Показано, что эстрадиол играет важную роль в поддержании нормального углеводного обмена: увеличивает чувствительность к инсулину, снижает уровень глюкозы в крови. Дефицит эстрогенов ассоциирован с повышенным риском развития сахарного диабета как первого, так и второго типа [7, 14].

Известно, что эстрадиол нормализует функцию печени, регулирует метаболизм липидов. Однако, высокие концентрации могут провоцировать холестаз [18].

Эффекты эстрадиола на состояние сосудистой системы имеют неоднозначный характер. С одной стороны, известен протективный эффект эстрогенов в патогенезе атеросклероза: под действием гормона нормализируется липидный профиль, что препятствует формированию бляшек в стенке сосуда. С другой стороны, эстрогены имеют выраженный прокоагулянтный эффект за счет стимуляции синтеза фибриногена и витамин К-зависимых факторов свертывания (II, VII, IX, X), а также снижения концентрации антитромбина III [10, 17].

В онкологии достоверно известно о роли эстрогенов в развитии некоторых форм рака груди и яичников. Имеются данные о корелляции между уровнем эстрадиола и риском развития колоректального рака, гепатоцеллюлярной карциномы. Однако, критические уровни для прогностического использования аналита еще предстоит установить [13].

Нельзя не упомянуть о модулирующих эффектах эстрадиола на работу как врожденного, так и приобретенного звеньев иммунной системы – на уровне изменения фагоцитарной активности, интенсивности синтеза противовоспалительных цитокинов. Изучается значение в патогенезе аутоиммунных заболеваний.

Активно изучается роль эстрогенов и в работе головного мозга и психики. Показано участие эстрадиола в формировании полового поведения. Есть данные о том, что низкие уровни гормона ассоциированы с риском развития астенических, депрессивных состояний и ожирения, обусловленного образом жизни. Пристальное внимание уделяется исследованию вероятного протективного эффекта эстрогенов в патогенезе нейродегенеративных заболеваний [5, 9, 16].

Таким образом, определение уровня эстрадиола является перспективным не только в эндокринологической и акушерско-гинекологической практике, но и в онкологии, кардиологии, травматологии, гастроэнтерологии и в области ментального здоровья.

Диагностическая значимость определения эстрадиола

Ключевыми особенностями эстрадиола, определяющими требования и подходы к разработке тест-систем для применения в рутинной лабораторной диагностике являются, во-первых, крайне широкий диапазон физиологических концентраций, встречающихся у различных групп пациентов, а во-вторых, структурное сходство молекул стероидных гормонов [8, 11].

Нормальная концентрация эстрадиола в сыворотке крови женщин детородного возраста составляет 20-750 пг/мл, в зависимости от фазы менструального цикла, в то время как для мужчин медиана физиологического диапазона в несколько раз ниже. Диапазоны значений для женщин в постменопаузе и детей близки к мужским (см. Таблицу 1). Широкий перечень патологических состояний, при которых показано определение уровня эстрадиола (СПКЯ, эндометриоз, гипогонадизм, остеопороз, гормон-зависимые формы опухолей, метаболический синдром и др.) требует достаточно точной оценки в пределах от <1 пг/мл для пациенток с раком груди, получающих лечение ингибиторами ароматазы, до нескольких тысяч в ходе протокола ЭКО [6, 8, 20]. Следует отметить, что значительное повышение уровня эстрадиола при наблюдении нормальной беременности в настоящее время не имеет клинического значения, так как наиболее выраженно повышается эстриол, а оценка развития плода ведется в большей степени при помощи инструментальных методов [19].

Такая ширина диапазона определяемых концентраций требует тщательной работы по подбору необходимого количества калибровочных проб и их концентраций. Наиболее обсуждаемым в настоящее время является точное определение низких концентраций эстрадиола, необходимое при работе с такими группами пациентов как женщины в период менопаузы, мужчины, дети допубертатного и раннего пубертатного возраста. В частности, у детей с нарушениями полового созревания погрешности в определении уровня эстрадиола недопустимы, так как коррекция нарушений ведется путем достижения целевого уровня половых стероидов (Wierman).

Таблица 1. Референтные интервалы определения уровня эстрадиола (Е2) [1]

В отличие от диагностических тест-систем первого поколения (прямой ИФА) которые имели низкие аналитические характеристики, коэффициенты вариации до 20% и могли использоваться исключительно для оценки фертильности женщин до менопаузы, характеристики тест-систем прямого ИФА уже второго поколения позволяли интерпретировать данные по таким группам пациентов как женщины в постменопаузе и фертильные мужчины. Современные тест-системы непрямого ИФА по чувствительности и специфичности сопоставимы с результатами, полученными методом масспектрометрии, который является «золотым стандартом» для определения концентраций стероидных гормонов [19]. Такие аналитические системы позволяют решить все задачи, стоящие перед клиницистами. Так, диапазон определяемых концентраций тест-системы «СтероидИФА-эстрадиол» производства «Алкор Био» составляет 0- 2 000 пг/мл, а аналитическая чувствительность – 8,6 пг/мл [2].

Однако проблема унификации калибровок в тест-системах различных производителей и стандартизации выполнения исследований в лабораториях (в том числе соблюдение правил сбора, транспортировки и хранения образцов до исследования) остается актуальной.

Также значимым обстоятельством является структурное сходство молекул стероидных гормонов. Эстрогены циркулируют в крови в виде более ста коньюгированных и неконьюгированных метаболитов, включая формы экзогенного происхождения, некоторые из которых могут искажать результаты анализа. В отношении наиболее близких эндогенных метаболитов степень интерференции в современных тест-системах лежит ниже порога клинической значимости (см. Таблицу 2) [2]*. В случае приема лекарственных препаратов или биологически активных добавок необходимо учитывать потенциальные искажения, либо рассмотреть возможность перерыва в приеме препарата для проведения исследования.

Таблица 2. Перекрестная интерференция 

*в наборе «СтероидИФА-эстрадиол» производства «Алкор Био» перекрёстная интерференция определялась путём измерения концентрации эстрадиола в контрольном образце и образцах, нагруженных кросс-реактантами.

Необходимым свойством современной тест-системы является корреляция с результатами, полученными при использовании аналогичных тест-систем других производителей, что позволяет достоверно оценивать динамику состояния пациентов при переходе лаборатории на новую методику и смене медицинского учреждения. Для проверки соответствия наборов «Алкор Био» этому условию были выбраны две тест-системы, работающие по принципу иммунохемилюминисцентного анализа (ИХЛА), и один набор реагентов для иммуноферментного анализа (ИФА). Проведенное исследование показало высокий коэффициент корреляции набора «СтероидИФА-эстрадиол» с зарубежными аналогами как для ИФА, так и для ИХЛА. Данные исследований приведены в Таблице 3.

Таблица 3. Сравнение коэффициентов корреляции результатов различных тест систем

Следует также отметить, что для внедрения набора «СтероидИФА-эстрадиол», «Алкор Био» не требуется приобретение специального оборудования сверх стандартного оснащения лаборатории и специального обучения персонала. Время, необходимое для выполнения исследования – 60 минут – также делает данную тест-систему оптимально подходящей для использования в любой клинической ситуации.

Диагностические алгоритмы, клиническое применение:  

Показания для назначения этрадиола чаще всего направлены оценку гипо- или гиперпродукции стероида. При гипоэстрогенных состояниях происходит снижение или прекращение выработки этого стероидного гормона. Причины для назначения теста могут быть следующие:

- после хирургических операций (частичная или полная резекция яичника, удаление кист, и т.д.);

- истощение фолликулярного аппарата;

- применение агонистов рилизин – гормонов;

- как следствие длинных протоколов стимуляции «суперовуляции» при ЭКО;

- пре- и менопауза;

- эндометриоз.

Особенностью количественного определения эстрадиола в клинической практике является то, что несмотря на широкий список состояний, при подозрении на которые показано определение эстрадиола, он практически никогда не используется самостоятельно. Наиболее широко применяется определение эстрадиола в комплексе с фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ), работающим по принципу отрицательной обратной связи. Такой подход используется, в частности, для уточнения причины нарушения менструального цикла, при уточнении формы бесплодия.

Также важно определять концентрацию эстрадиола в крови в комплексе с антимюллеровским гормоном (АМГ) при уточнении овариального ресурса у женщин в репродуктивном периоде. Традиционно уровень эстрадиола принято измерять в раннюю фолликулиновую фазу менструального цикла (3-5 день).

Показания:

• Нарушения полового созревания
• Нарушения менструального цикла и фертильности у женщин: аменорея, олигоменорея, ановуляция, гипогонадизм, предменструальный синдром, бесплодие, маточные кровотечения в период менопаузы (в комплексе с определением гонадотропинов)
• Нарушение полового созревания, появление половых признаков, не соответствующих полу
• Выяснение причин раннего пубертата, задержки пубертата
• Остеопороз у женщин
• Гирсутизм, акне
• Контроль медикаментозно стимулированной овуляции, оценка функционирования фетоплацентарного комплекса на ранних сроках беременности, контроль за лечением бесплодия
• Диагностика опухолей, вырабатывающих эстрогены
• Контроль за лекарственной терапией эстрогенами
• Признаки феминизации у мужчин (гинекомастия) [1, 3, 4].

 Таблица 4.  Заболевания и состояния, при которых может изменяться концентрация эстрадиола в сыворотке крови [1,3, 4].

Стимуляция яичников при проведении ЭКО проводится под контролем уровня эстрадиола в сыворотке. Эти данные помогают получить в ходе протокола достаточное количество зрелых ооцитов и не допустить развития синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ).

Пациентки с так называемым низким уровнем ответа (<75 пг/мл на 4 день) имеют низкие шансы наступления беременности и высокий риск отторжения эмбриона в данном цикле, а пациентки с высоким уровнем ответа (>3000 пг/мл) имеют высокий риск СГЯ [20].

Пример в клинической практике. На прием к гинекологу-эндокринологу обратилась женщина 49 лет, в анамнезе сохраненный менструальный цикл, отсутствие косвенных клинических признаков гипоэстрогении (лабильность психического состояния, сухость кожных покровов, чувство «приливов» и жара и др.). Планирует первую беременность.  Цель визита пациентки заключалась в следующем: оценить репродуктивный статус с помощью лабораторных тестов. Назначены следующие тесты: ФСГ, ЛГ, эстрадиол, АМГ в фолликулиновую фазу менструального цикла (3-5 день м.ц.). Исследование ФСГ, ЛГ, эстрадиола проводилось с помощью ИФА с использование тест-систем «Алкор Био». Анализ АМГ проводился также иммуноферментной методикой. По результатам исследования выявлены следующие показатели: ФСГ - 10.5 мМЕ/мл (референсный диапазон (3.5 - 12.5 мМЕ/мл для репродуктивного периода в фолликулиновую фазу), ЛГ - 4.07 мМЕ/мл (рефернсный интервал (2.4 - 12.6 мМЕ/мл для репродуктивного периода в фолликулиновую фазу). Эстрадиол – 155 пг/мл (референсный диапазон в фолликулиновую фазу 20 - 350 пг/мл). Однако АМГ составил достаточно низкую цифру - 0.17 нг/мл (референсный диапазон 0- 12.6 нг/мл), что означает резкое снижение функционального резерва яичников. Лечащий доктор, ориентируясь на низкие показатели АМГ, низкие значения соотношения ЛГ/ФСГ, предположил невозможность зачатия в данном случае, хотя по лабораторным показателям уровень эстрадиола выглядит вполне «ресурсным» для данной цели. Несмотря на неутешительные прогнозы клинициста, пациентка успешно забеременела в течение последующих 3-х месяцев. Этот и подобные случаи не оставляют сомнений в значимости измерения концентрации эстрадиола и позволяют подтвердить сопоставимость лабораторных тестов с клинической картиной.

Выводы:

1. Тест-система «СтероидИФА-эстрадиол» производства «Алкор Био» является высокочувствительным тестом, отвечающим современным требованиям. Аналитический диапазон метода является достаточным для диагностики основных нозологических состояний, требующих оценки данного метаболита .
2. Результаты, полученные с помощью тест-системы «СтероидИФА-эстрадиол» «Алкор Био», сопоставимы со значениями, полученными при использовании реактивов других производителей, демонстрируют высокую корреляцию с ИХЛА-тестами и могут быть использованы для оценки динамики состояния пациента.
3. Время и оснащение, необходимые для проведения теста делают его доступным для большинства лабораторий и, соответственно, для пациентов.
4. Характеристики тест-системы позволяют решить большинство задач, возникающих в клинической практике.
    
   

Литература:

1. Алан Г.Б. Ву Клиническое руководство Тица по лабораторным тестам. 4 издание, ред А.Ву., М., Лабора, 2013, 1280 с.
2. Камышников В.С., Алехнович Л.И., Василиу-Светлицкая С.Г. Клиническая лабораторная диагностика. Методыитрактовкалабораторныхисследований. - М.: МЕД-пресс-информ, 2015.
3. Кишкун А.А. Клиническая лабораторная диагностика. - М.: ГЭОТАР — Медиа 2015.
4. Alessandro Villa, ElisabettaVegeto, Angelo Poletti, and Adriana Maggi Estrogens, Neuroinflammation, and Neurodegeneration.Endocr Rev. 2016 Aug; 37(4): 372–402.
5. Anne Mette Lund Würtz, Anne Tjønneland, Jane Christensen, Lars Ove Dragsted, Julie Aarestrup, CecilieKyrø, Kim Overvad, Anja OlsenSerum estrogen and SHBG levels and breast cancer incidence among users and never users of hormone replacement therapy Cancer Causes Control 2012 Oct;23(10):1711-20.
6. Franck Mauvais-Jarvis, Deborah J. Clegg, and Andrea L. HevenerThe Role of Estrogens in Control of Energy Balance and Glucose Homeostasis. Endocr Rev. 2013 Jun; 34(3): 309–338.
7. Genna Rollins A call for better estradiol measurement 2013, May https://www.aacc.org/cln/articles/2013/may/estradiol
8. HadineJoffe, Anouk de Wit , Jamie Coborn, Sybil Crawford, Marlene Freeman, Aleta Wiley, GeenaAthappilly, Semmie Kim, Kathryn A Sullivan, Lee S Cohen, Janet E Hall Impact of Estradiol Variability and Progesterone on Mood in Perimenopausal Women With Depressive Symptoms.J ClinEndocrinolMetab 2020 Mar 1;105(3):e642-e650.
9. Howard N. Hodis, M.D., Wendy J. Mack, Ph.D., Victor W. Henderson, M.D., Donna Shoupe, M.D., Matthew J. Budoff, M.D., Juliana Hwang-Levine, Pharm.D., Yanjie Li, M.D., Mei Feng, M.D., Laurie Dustin, M.S., Naoko Kono, M.P.H., Frank Z. Stanczyk, Ph.D., Robert H. Selzer, M.S., Stanley P. Azen, Ph.D., and the ELITE Research Group, Vascular Effects of Early versus Late Postmenopausal Treatment with Estradiol.NEngl J Med. 2016 Mar 31; 374(13): 1221–1231.
10. Hubert W Vesper, Julianne C Botelho, and Yuesong WangChallenges and improvements in testosterone and estradiol testing Asian J Androl. 2014 Mar-Apr; 16(2): 178–184.
11. Jennifer H Lin , Shumin M Zhang, Kathryn M Rexrode, Joann E Manson, Andrew T Chan, Kana Wu, Shelley S Tworoger, Susan E Hankinson, Charles Fuchs, J Michael Gaziano, Julie E Buring, Edward GiovannucciAssociation between sex hormones and colorectal cancer risk in men and women. ClinGastroenterolHepatol 2013 Apr;11(4):419-424.
12. Ji Young Oh, Gee Euhn Choi, Hyun Jik Lee, Young Hyun Jung, Chang Woo Chae, Jun Sung Kim, Chang-Kyu Lee, Ho Jae Han17β-Estradiol protects mesenchymal stem cells against high glucose-induced mitochondrial oxidants production via Nrf2/Sirt3/MnSOD signaling. Free RadicBiol Med. 2019 Jan; 130:328-342.
13. Jie Cui, Yong Shen, and Rena Li Estrogen synthesis and signaling pathways during ageing: from periphery to brain. TrendsMolMed. 2013 Mar; 19(3): 197–209.
14. Kristen N. Krolick,Qi Zhuand Haifei ShiEffects of Estrogens on Central Nervous System Neurotransmission: Implications for Sex Differences in Mental DisordersProgMolBiolTransl Sci. 2018; 160: 105–171.
15. Rebecca C Thurston, ShalenderBhasin, Yuefang Chang, Emma Barinas-Mitchell, Karen A Matthews, Ravi Jasuja, Nanette Santoro Reproductive Hormones and Subclinical Cardiovascular Disease in Midlife Women. J ClinEndocrinolMetab. 2018 Aug 1;103(8):3070-3077.
16.  Rosner W, Hankinson SE, Sluss PM, et al. Challenges to the measurement of estradiol: An endocrine society position statement. J ClinEndocrinolMetab 2013;98: 1353–60. Copyright 2013, The Endocrine Society.

17. Инструкция к набору «СтероидИФА-эстрадиол» Алкор Био

18.  J Neulen, H P Zahradnik, U Flecken, M Breckwoldt, Effects of estradiol-17 beta and progesterone on the synthesis of prostaglandin F2 alpha, prostaglandin E2 and prostaglandin I2 by fibroblasts from human endometrium in vitro. Prostaglandins, 1988 Jul;36(1):17-30.

19.  Richard J Santen, Evan SimpsonHistory of Estrogen: Its Purification, Structure, Synthesis, Biologic Actions, and Clinical Implications  Endocrinology, Volume 160, Issue 3, March 2019, Pages 605–625, https://doi.org/10.1210/en.2018-00529

20. TheocharisPapageorgiou, JulietteGuibert, FrançoisGoffinet, CatherinePatrat, YvonneFulla, YvetteJanssens, Jean-RenéZornPercentilecurvesofserumestradiollevelsduringcontrolledovarianstimulationin 905 cyclesstimulatedwithrecombinant FSH showthathighestradiolisnotdetrimentalto IVF outcome.  HumanReproduction, Volume 17, Issue 11, November 2002, Pages 2846–2850.