Журнал «Клиническая лабораторная диагностика» №4 2023г. https://www.elibrary.ru/item.asp?id=50495872

МИКРОБИОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2023

Никольский М.А.¹, Ведерников В.Е.², Вязовая А.А.³, Домонова Э.А.⁴, Лисок А.В.², Лиознов Д.А.^1,5

¹ФГБОУ ВПО Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава РФ, Санкт-Петербург, Россия;

²ГК «Алкор Био» Санкт-Петербург, Россия;

³ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург, Россия;

⁴ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия;

⁵ФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева,  Санкт-Петербург, Россия

Вирус герпеса человека 6 (ВГЧ-6) с 2012 года подразделяют на два биологических вида - ВГЧ-6А и ВГЧ-6В. Данные о циркуляции этих видов в России ограничены. Целью нашей работы была апробация и доклинические испытания отечественного набора реагентов для выявления и видовой дифференциации вирусов герпеса человека 6А и 6В методом ПЦР (ГК «Алкор Био», г. Санкт-Петербург). Изучены образцы биологического материала 239 детей и взрослых с острой и латентной ВГЧ-6А/В-инфекцией и подозрением на хромосомно-интегрированный ВГЧ-6А/В-статус. Для подтверждения результатов дифференциации использовали параллельное тестирование образцов с помощью двух альтернативных методик и секвенирование. Дополнительно проведена апробация на панели контрольных образцов ДНК ВГЧ-6А/В.  Видовая дифференциация ВГЧ-6А и ВГЧ-6В происходит независимо от исходных концентраций ДНК вирусов в исследуемом образце. Аналитическая специфичность – 100%. Показана 100% сходимость обнаружения и дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В, полученных с помощью изучаемого набора реагентов и двух альтернативных референсных систем. Результаты подтверждены секвенированием по Сэнгеру.При тестировании панели контрольных образцов ДНК ВГЧ-6А/В установлено 100% совпадение результатов. Отечественный набор реагентов для видовой дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В методом ПЦР может быть использован как для диагностики, так и в эпидемиологических исследованиях.

Ключевые слова: ВГЧ-6А; ВГЧ-6В; хиВГЧ-6А/В; ВГЧ-6А/В-инфекция; внезапная экзантема; секвенирование.

Для цитирования: Никольский М.А., Ведерников В.Е., Вязовая А.А., Домонова Э.А., Лисок А.В., Лиознов Д.А.Апробация и доклинические испытания отечественного набора реагентов для видовой дифференциации вирусов герпеса человека 6А и 6В. Клиническая лабораторная диагностика. 2023: 68:   DOI: https://doi.org/10.51620/0869-2084-2023-68-

Для корреспонденции: Никольский Михаил Андреевич, врач-педиатр, канд. мед. наук, асс. каф. педиатрии; е-mail: nicolm@inbox.ru

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Since 2012, human herpes virus 6 (HHV-6) was divided into two different species (HHV-6A and HHV-6B). These variants have various geographical predominance and clinical manifestation, but there is no enough data about prevalence of HHV-6 species in Russia. The aim of our study was to test a novel PCR set of reagents for HHV-6A/B detection and differentiation, designed and manufactured by the “Alkor Bio” company.  239 patients with acute or latent HHV-6A/B-infection or iciHHV-6A/B were tested by novel PCR set of reagents and in parallel by two other reference PCR test systems and sequencing. All tested samples were typed as HHV-6B. Novel PCR set of reagents showed 100% analytical specificity and full concordance with two other reference PCR test systems and Sanger sequencing. The novel PCR set of reagents from “Alkor Bio” company for HHV-6A and HHV-6B species detection and differentiation can be used both for diagnostics and in epidemiological studies.

Key words: HHV-6A; HHV-6B; iciHHV-6A/B; exanthem subitum; sequencing.

Вирус герпеса человека 6 (ВГЧ-6) идентифицирован в 1986 г. [1]. Уже через несколько лет были выявлены новые штаммы этого же вируса, имеющие значимые молекулярно-биологически отличия. В 1992 г. предложено разделить ВГЧ-6 на два варианта А и В. Эти два варианта in vitro демонстрируют различия по тропизму к Т-клеткам, особенностям иммунологического ответа и последовательности ДНК [2, 3]. В виду отсутствия сведений о межвидовой рекомбинации вируса герпеса человека 6А (ВГЧ-6А) и вируса герпеса человека 6В (ВГЧ-6В), сделан вывод, что они занимают разные экологические ниши [4]. Согласно новой международной классификации, принятой в 2012 г., ВГЧ-6А и ВГЧ-6В являются самостоятельными таксономическими единицами [5, 6].

ВГЧ-6А и ВГЧ-6В – ДНК–содержащие вирусы, принадлежащие семейству Herpesviridae, подсемейству Betaherpesvirinae, роду Roseolovirus. ВГЧ-6А и ВГЧ-6В различаются по последовательности нуклеотидов, особенностям культивирования, эпидемиологическим данным. Нуклеотидные последовательности ВГЧ-6А и ВГЧ-6В совпадают в 75–95% в зависимости от сравниваемого гена. Кроме того, ряд исследований продемонстрировал различия процесса сплайсинга и регуляции транскрипции [7]. Имеют место географические различия в распространенности ВГЧ-6А и ВГЧ-6В, хотя возможна и одновременная циркуляция обоих видов на одной территории [8, 9].

ВГЧ-6В значительно чаще, чем ВГЧ-6А, вызывает острую инфекцию у детей (внезапная экзантема, лихорадка без сыпи), а также ассоциирован с фебрильными судорогами и височной эпилепсией. К тому же ВГЧ-6В, в отличие от ВГЧ-6А, резистентен к противовирусному действию альфа- и бета-интерферонов [10]. ВГЧ-6А чаще выявляется у взрослых людей с хроническими заболеваниями [11]. Несмотря на то, что оба вируса являются нейротропными, ВГЧ-6А оказывает более серьезное воздействие на организм человека [12] и встречается чаще, чем ВГЧ-6В, при рассеянном склерозе и ромбэнцефалите [13].

В зарубежной литературе представлены данные о способности реактивации обоих вариантов после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток [14] и органов [15]. ВГЧ-6А и ВГЧ-6В могут интегрироваться в субтеломерную/теломерную область хромосом человека и передаваться по наследству (хромосомно-интегрированный ВГЧ-6А и ВГЧ-6В – хиВГЧ-6А, хиВГЧ-6В) [16].

Как ВГЧ-6А, так и ВГЧ-6В, тропны к CD4+-лимфоцитам [17]. В отличие от ВГЧ-6В, ВГЧ-6А способен инфицировать также CD8+-лимфоциты и натуральные киллеры [18]. Кроме того, он успешно реплицируется в нейральных стволовых клетках, а также в клетках-предшественниках астроцитов и олигодендроцитов [19]. Вирусы используют разные клеточные рецепторы для проникновения: ВГЧ-6А – CD46, ВГЧ-6В – CD134 [20, 21]. Эти различия могут объяснять различную их тропность к тканям и отличающийся спектр патологии.

На текущий момент используемые традиционные иммунохимические методы, направленные на выявление и количественное определение вирусоспецифических антител, не способны различить ВГЧ-6А и ВГЧ-6В. Для научных целей создана мультиплексная методика, позволяющая провести дифференциацию антител класса G к антигенам ВГЧ-6А и ВГЧ-6В [22]. Но чаще для дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В используются молекулярно-генетические методы: ПЦР и секвенирование (определение последовательностей нуклеотидов нуклеиновой кислоты).

Известен способ дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В (JP2003135100 (A), 2003-05-13) на основе разницы длин амплифицируемых фрагментов для различных подтипов с последующей электрофоретической детекцией. Для анализа выбран ген U89/90, отличающийся наличием инсерций размером 108 и 228 п.н. для ВГЧ-6В относительно ВГЧ-6А. Недостатком способа является использование для анализа электрофоретической детекции и вариабельность размеров инсерций [23].

Более перспективными для использования являются методики на основе ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов анализа в режиме «реального времени» для которых задача по дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В может быть сведена к определению однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП), позволяющих специфично различать указанные виды.

Потребность в быстрых, производительных, недорогих тестах для анализа ОНП привело к бурному развитию различных методов для дискриминации аллельных вариантов: на основе лигирования [24], масс-спектроскопии [25]; ДНК-микрочипа [26]; анализа длин рестрикционных фрагментов [27]; зондов типа TaqMan [28]; анализа кривой плавления [29] и др. Наиболее распространенной за счет высокой чувствительности, специфичности и надежности интерпретации результатов является технология TaqMan.

Отсутствие в России зарегистрированных наборов реагентов для дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В до настоящего времени не позволяло изучить соотношение видов в популяции ВГЧ-6.

Целью нашей работы явилась апробация и проведение доклинических испытаний набора реагентов для обнаружения и видовой дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В на основе метода ПЦР.

Материал и методы.  Разработка набора реагентов осуществлена в ГК «Алкор Био», Санкт-Петербург. Техническим результатом изобретения является способ определения ВГЧ-6А и ВГЧ-6В на основе технологии TaqMan. При использовании заявленного способа исследования могут проводиться в одной пробирке на амплификаторах с тремя каналами детекции [30]. Определение ВГЧ-6А и ВГЧ-6В осуществляется по фрагменту последовательности гена U67, содержащей два ОНП, что позволяет дифференцировать виды. В качестве внутреннего эндогенного контроля используется фрагмент ДНК гена B2M (beta-2-microglobulin). Амплификация ДНК гена B2M не конкурирует с определением ВГЧ-6А, ВГЧ-6B и позволяет по значениям пороговых циклов Cq контролировать преаналитический и аналитический этапы исследования. В процессе амплификации происходит специфическое связывание и последующее расщепление соответствующих зондов, в результате чего повышается уровень флуоресценции, который фиксируется детектором амплификатора в режиме «реального времени» одновременно по каналам: HEX – для ВГЧ-6А, ROX – ВГЧ-6В и FAM – B2M.

Последовательности специфических праймеров и зондов, используемых для видовой дифференциации вирусов и детекции внутреннего эндогенного контроля описаны в патенте [30].

Состав реакционной смеси (общий объём 30 мкл): 50 mM Tris-SO₄, pH 8,0; 10 mM (NH₄)₂SO₄; 3,5 mM MgCl₂; 30 mM KCl; 0,01 % Tween-20; по 0,25 mM каждого dNTP; по 3 pM праймеров и по 1,5 pM зондов; 2,5 е.а. TaqM ДНК-полимеразы производства ООО «Компания Алкор Био» (Россия) и 5 мкл ДНК выделенной из биологического образца.

Параметры циклирования: «горячий старт» в течение 15 мин при 95⁰С; 45 циклов в режиме 95⁰С в течение 10 с, 60⁰С в течение 20 с с детекцией флуоресцентного сигнала для флуорофоров FAM, HEX и ROX. Постановку ПЦР проводили на термоциклере для амплификации нуклеиновых кислот «CFX96 Touch» («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США).

При апробации разработчиками набора реагентов проведено изучение влияния исходной концентрации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В в тестируемом образце на получаемые результаты ПЦР-анализа. Исследование проводили с использованием стандартных образцов предприятия (СОП). В качестве высококонцентрированной матрицы использовали СОП с Cq=20±2, а низкоконцентрированной – Cq=30±2. Для каждой комбинации концентраций ДНК вирусов тестирование проводилось в 8 повторениях. Схема эксперимента представлена в табл. 1.

Таблица 1

 Схема эксперимента по исследованию взаимного ингибирования двух выявляемых специфических мишеней (ДНК ВГЧ-6А и ДНК ВГЧ-6В)

Аналитическую специфичность оценили при тестировании образцов геномной ДНК человека и панели ДНК следующих микроорганизмов: Humanalphaherpesvirus 1, Humanalphaherpesvirus2, Humanalphaherpesvirus3, Humangammaherpesvirus 4, Humanbetaherpesvirus 5, Humanbetaherpesvirus 7. Кроме того, оценили insilico методом выравнивания последовательности целевого специфического участка с ДНК Trichomonas vaginalis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Neisseria gonorrhoeae, Toxoplasma gondii, Mycoplasma sp., Ureaplasma sp., Candida albicans, Enterococcus faecalis, Gardnerella vaginalis, Staphylococcus aureus, Lactobacillus acidophilu.

На первом этапе доклинических испытаний разработанного набора реагентов в ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера (НИИЭМ им. Пастера) исследованы 239 образцов ДНК, экстрагированных из образцов плазмы (n=124) или сыворотки (n=40) или лейкоцитов (n=5) венозной крови детей с острой ВГЧ-6А/В-инфекцией, полученных в Детской городской клинической больнице им. Н.Ф. Филатова (ДГКБ № 5), НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой (НИИ ДОГиТ); ногтевых пластин (n=22) пациентов с подозрением на хиВГЧ-6А/В–статус, собранных в ДГКБ № 5 и амбулаторно; слюны (n=48) детей и взрослых с латентной ВГЧ-6А/В–инфекцией, наблюдавшихся амбулаторно в Санкт-Петербурге.

Ранее от обследуемых и/или их родителей (опекунов) было получено добровольное информированное согласие на исследование.

На втором этапе работы выполнено параллельное тестирование 120 биологических образцов плазмы венозной крови детей из вышеописанной выборки с выявленным ВГЧ-6А/В с использованием двух альтернативных референсных систем на основе технологии TaqMan: согласно описанию, представленному в патенте CN103820574B к гену U38 [31] и по J. Yavarian и соавт. [32] к гену U41.

Дополнительно, для подтверждения полученных результатов проведено секвенирование по Сэнгеру 49 образцов фрагмента гена U86 длиной 547 п.н., который идентичен между ВГЧ-6А и ВГЧ-6В менее чем на 70% и у ВГЧ-6А несет делецию длиной 15 п.н. [33]. Результаты секвенирования сравнивались с референсными последовательностями HHV-6A NC_001664 и HHV-6B NC_000898.

На заключительном этапе проведена апробация отечественного набора реагентов для видовой дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В методом ПЦР на панели контрольных образцов ДНК ВГЧ-6А/В, разработанной в отделе молекулярной диагностики и эпидемиологии ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва).

Контрольная панель включала в себя 12 зашифрованных образцов: 10 положительных и 2 отрицательных. Положительные образцы представляли собой препараты очищенной ДНК клинических изолятов ВГЧ-6А или ВГЧ-6В, выделенных от пациентов с хиВГЧ-6А, хиВГЧ-6В или больных ВЭ. Отрицательные – препараты очищенной ДНК, экстрагированной из биологического материала, не содержащего ВГЧ-6А/В. Все образцы ДНК были выделены с помощью комплекта реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора). Количественное определение ДНК ВГЧ-6А/В выполняли методом ПЦР-РВ с использованием набора реагентов «АмплиСенс^®HHV6-скрин-титр-FL» (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора). Постановку и анализ результатов амплификации проводили на приборе с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» «Rotor-Gene Q», «Qiagen GmbH», Германия). Видовую принадлежность устанавливали на основании анализа данных, полученных методом массового параллельного секвенирования («MiSeq», Illumina, США), описанных ранее [34, 35].

Расшифровку панели контрольных образцов ДНК ВГЧ-6А/В осуществляли в НИИЭМ им. Пастера. Идентификацию ДНК в анализируемых образцах проводили методом ПЦР-РВ с использованием разработанного набора реагентов (ГК «Алкор Био»). Постановку ПЦР проводили на термоциклере для амплификации нуклеиновых кислот «CFX96 Touch» (Bio-Rad Laboratories, Inc., США).

Результаты. В ходе апробации разработанного набора реагентов установлено, что видовая дифференциация ВГЧ-6А и ВГЧ-6В происходит независимо от исходных концентраций ДНК вирусов в исследуемом образце. На рисунке  представлены кривые флуоресценции в соответствии с табл. 1.

а                                                                                                        б

в	г

Кривые флуоресценции при исследовании влияния амплификации ДНК вирусов ВГЧ-6А и ВГЧ-6В в различной концентрации друг на друга.

а – высокая вирусная нагрузка вирусов ВГЧ-6A и ВГЧ-6В; б – высокая вирусная нагрузка вируса ВГЧ-6A при низкой ВГЧ-6В; в - высокая вирусная нагрузка вируса ВГЧ-6В при низкой ВГЧ-6А; г - низкая вирусная нагрузка вирусов ВГЧ-6A и ВГЧ-6В.

Круглым маркером обозначены кривые флуоресценции по каналу HEX (ВГЧ-6A), треугольным маркером обозначены кривые флуоресценции, соответствующие каналу ROX (ВГЧ-6В).

При тестировании образцов ДНК человека и панели ДНК 6 микроорганизмов (Humanalphaherpesvirus 1, Humanalphaherpesvirus2, Humanalphaherpesvirus3, Humangammaherpesvirus 4, Humanbetaherpesvirus 5, Humanbetaherpesvirus 7) неспецифических реакций не обнаружено. По результатам анализа in silico отсутствуют неспецифические реакции с ДНК Trichomonas vaginalis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Neisseria gonorrhoeae, Toxoplasma gondii, Mycoplasma sp., Ureaplasma sp., Candida albicans, Enterococcus faecalis, Gardnerella vaginalis, Staphylococcus aureus, Lactobacillus acidophilu.

В рамках доклинических испытаний отечественного набора реагентов для видовой дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В в ДГКБ № 5 в обследование были включены 166 больных (88 мальчиков, 78 девочек) в возрасте от 9 дней до 33 месяцев жизни (средний возраст – 10,5±0,6 месяцев) с острой ВГЧ-6А/В-инфекцией.

Проанализированы особенности клинического анализа крови у детей с острой ВГЧ-6А/В-инфекцией. У большинства обследованных он характеризовался нормальным содержанием лейкоцитов (53,6%) или лейкопенией (20,5%), также была типична нейтропения и/или лимфоцитопения (суммарно 57% больных). Лейкоцитоз не был характерен для острой ВГЧ-6А/В-инфекции и встречался в 4,8% случаях при наличии сопутствующих заболеваний.

На основании выявленных симптомов и данных лабораторного обследования у 150 пациентов был выставлен диагноз внезапной экзантемы (ВЭ). ВЭ была типичной (3-4 суток высокая температура тела с последующим появлением типичной пятнисто-папулезной сыпи) у большинства пациентов (92%). У 8% детей ВЭ была атипичной – сыпь появлялась после однократного подъема температуры тела выше 38° С или через 2-3 дня субфебрильной температуры. Фебрильные судороги на фоне ВЭ были у 13 пациентов (7,8%).

У девяти детей была лихорадка без сыпи (ЛС). ЛС характеризовалась подъемом температуры тела в течение 3–4 суток, но после ее нормализации сыпи не регистрировалось.

У пяти новорожденных детей была сыпь без лихорадки. В двух случаях сыпь была яркой, похожей на многоформную крапивницу, описанной рядом авторов [36] и послужила основной причиной госпитализации, в остальных – пятнисто-папулезной. Сыпь проходила бесследно в течение нескольких дней.

У двух обследованных новорожденных детей не было ни лихорадки, ни сыпи.

У трети пациентов с острой ВГЧ-6А/В-инфекцией заболевание манифестировало на фоне острого респираторного заболевания (ОРВИ, бронхиты, бронхиолиты, пневмонии) – 34 пациента (20%), острых кишечных инфекций (в основном ротавирусной природы – 22 пациента (13%)). У 10 пациентов (6%) была клиническая картина мононуклеозоподобного синдрома.

ДНК ВГЧ-6А/В была определена у всех пациентов (n=166) с ВЭ, ЛС, мононуклеозоподобным синдромом.

Среди пациентов НИИДОГиТ острая ВГЧ-6В-инфекция была выявлена у трех детей. Больные были обследованы до и после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) в динамике на 14, 28, 30 день (табл. 2).

Таблица 2

 Диагнозы и вид ТГСК у пациентов НИИ ДОГиТ

Примечание. * - Источник ТГСК (трансплантации гемопоэтических стволовых клеток) – КМ – костный мозг; ** - различия в режимах кондиционирования – МАК – миелоаблативный, РИК – режим кондиционирования со сниженной токсичностью.

У одного пациента произошла реактивация ВГЧ-6В на 14-й день после ТГСК. Во втором случае острая первичная инфекция, вызванная ВГЧ-6В, зарегистрирована на 24 день. У третьего больного первичная ВГЧ-6В-инфекция выявлена на 30-й день после ТГСК. У всех пациентов после ТГСК клиническими проявлениями острого инфекционного процесса были лихорадка и нейтропения.

В слюне 48 больных (от 1 года жизни до 54 лет), наблюдавшихся у инфекциониста в амбулаторном центре НИИЭМ им. Пастера, был также выделен ВГЧ-6В. Основными причинами обследования на ВГЧ-6А/В пациентов были синдром хронической усталости, частые и длительные респираторные заболевания, рецидивирующие герпетические инфекции, подозрение на иммунодефицитное состояние.

Кроме этого, ВГЧ-6В был выделен из образцов ногтевых пластин 22 пациентов и их ближайших родственников с подозрением на хиВГЧ-6А/В–статус. Поиск производился как у пациентов ДГКБ № 5 с высокой вирусной нагрузкой в плазме венозной крови, так и у пациентов, обратившихся амбулаторно [37].

Таким образом, во всех 239 образцах биологического материала, исследованных на первом этапе доклинических испытаний разработанного набора реагентов, у детей и взрослых с различными диагнозами, с острой и латентной инфекцией, вызванной ВГЧ-6А/В, а также с подозрением на хиВГЧ-6А/В, определен ВГЧ-6В.

Параллельное тестирование 120 образцов, экстрагированных из плазмы венозной крови, с помощью двух альтернативных референсных систем и филогенетический анализ результатов секвенировании по Сэнгеру 49 образцов ДНК подтвердили, что во всех образцах обнаружена ДНК ВГЧ-6В.

Результаты апробации набора реагентов для видовой дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В методом ПЦР на панели контрольных образцов ДНК ВГЧ-6А/В (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора), полученные на заключительном этапе исследования, представлены в табл. 3. Среди зашифрованных образцов контрольной панели были определены: в двух случаях ДНК ВГЧ-6B, восьми – ДНК ВГЧ-6А, двух – ДНК вирусов не обнаружена. Как видно из табл. 3, расхождений в полученных данных с разработчиком контрольной панели не выявлено.

Таблица 3

Сопоставление результатов тестирования образцов контрольной панели

Обсуждение. До сих пор значительное число представленных эпидемиологических и клинических исследований не разграничивают ВГЧ-6А и ВГЧ-6В, что ведет к получению недостоверных данных об этих различных уникальных видах.

В клинической практике определение видов ВГЧ-6А и ВГЧ-6В важно. Например, показано, что выявление ВГЧ-6А чаще всего свидетельствует о наследуемой хромосомной интеграции – хиВГЧ-6А–статусе пациента, не требующем назначения противовирусной терапии [38].

Существуют только единичные отечественные исследования, посвященные изучению ВГЧ-6А и ВГЧ-6В. Так, при обследовании в Московском регионе образцов крови 59 детей в возрасте от 1 года до 10 лет с установленной инфекцией, вызванной ВГЧ-6А/В (клинически здоровыми были 14 человек, с проявлениями острой респираторной инфекции – 45) у 27 (46%) детей был выявлен ВГЧ-6А, ВГЧ-6В – у 31 (53%), у одного пациента вид не определен [39]. Для видовой дифференциации использована методика, описанная J.Yavarian и соавт. [32].

В других исследованиях определение уникального вида ВГЧ-6А или ВГЧ-6В у пациентов с хиВГЧ-6А/В–статусом осуществлялось при использовании метода массового параллельного секвенирования [34, 35, 40] с целью последующего филогенетического анализа. Однако данный метод дорог и не доступен для рутинной клинической практики.

В соответствии с полученным нами в ходе апробации и доклинического испытания разработанного набора реагентов результатами ВГЧ-6В превалирует у детей с ВГЧ-6А/В–инфекцией в Санкт-Петербурге. Изучаемый набор реагентов, разработанный ГК «Алкор Био» позволил в кратчайшие сроки провести дифференцировку уникальных видов ВГЧ-6А/В в условиях стандартной ПЦР-лаборатории.

Выводы

1. Проведены апробация и доклинические испытания отечественного набора реагентов для обнаружения и видовой дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В методом ПЦР в различном биологическом материале (плазма, сыворотка, лейкоциты крови; слюна, ногтевые пластины, моча).

2. Установлено, что видовая дифференциация ВГЧ-6А и ВГЧ-6В при использовании разработанного набора реагентов происходит независимо от исходных концентраций ДНК вирусов в исследуемом образце. Аналитическая специфичность – 100%.

3. Показана 100% сходимость обнаружения и дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В, полученных с помощью изучаемого набора реагентов и двух альтернативных референсных систем. Результаты подтверждены секвенированием по Сэнгеру.

4. Разработанный набор реагентов позволил провести идентификацию ДНК ВГЧ-6A и ВГЧ-6B и показал 100% совпадение результатов при тестировании панели контрольных образцов ДНК ВГЧ-6А/В.

5. Отечественный набор реагентов для выявления и видовой дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В методом ПЦР может быть использован как для диагностики, так и в эпидемиологических исследованиях.

ЛИТЕРАТУРА

1. Salahuddin S.Z., Ablashi D.V., Markham P.D.  Isolation of a new virus, HBLV, in patients with lymphoproliferative disorders. Science. 1986; 234(4776):596–601.
2. Wyatt L.S., Balachandran N., Frenkel N. Variations in the replication and antigenic properties of human herpesvirus 6 strains. J. Infect. Dis. 1990; 162(4):852–7.
3. Ablashi D.V., Balachandran N., Josephs S.F. et al. Genomic polymorphism, growth properties, and immunologic variations in human herpesvirus-6 isolates. Virology 1991;184(2):545–52.
4. Ablashi D, Agut H, Berneman Z, et al. Human herpesvirus-6 strain groups: a nomenclature. Arch Virol 1993;129(1):363–6.
5. Davison A., Pellett P., Stewart J. Rename species in the family Herpesviridae to incorporate a subfamily designation//ICTVonline. – Code assigned: 2015.010aD. – 5p.. 

6. Ablashi D, Agut H, Alvarez-Lafuente R et al. Classification of HHV-6A and HHV-6B as distinct viruses. Arch Virol. 2014 May;159(5):863-70.
7. Dominguez G, Dambaugh TR, Stamey FR, Dewhurst S, Inoue N, Pellett PE. Human herpesvirus 6B genome sequence: coding content and comparison with human herpesvirus 6A. J. Virol. 1999; 73(10):8040–52.
8. Bates M, Monze M, Bima H, et al. Predominant human herpesvirus 6 variant A infant infections in an HIV-1 endemic region of Sub-Saharan Africa. J. Med. Virol. 2009; 81(5):779–89.
9. Leibovitch E.C., Brunetto G.S., Caruso B. Сoinfection of Human Herpesviruses 6A (HHV-6A) and HHV-6B as Demonstrated by Novel Digital Droplet PCR Assay. PLoS One. 2014;  9(3)
10. Jaworska J, Gravel A, Flamand L. Divergent susceptibilities of human herpesvirus 6 variants to type I interferons. Proc Natl Acad Sci USA. 2010;107:8369–8374.
11. Flamand L., Lautenschlager I., Krueger G. Ablashi D. Human Herpesviruses HHV-6A, HHV-6B, and HHV-7. Diagnosis and Clinical Management. 3^rd ed.  2014.
12. Hall CB, Caserta MT, Schnabel KC,  et al. Persistence of human herpesvirus 6 according to site and variant: possible greater neurotropism of variant A. Clin. Infect. Dis. 1998; 26(1):132–7.
13. Alvarez-Lafuente R, De Las Heras V, Bartolome M, Picazo JJ, Arroyo R. Relapsing-remitting multiple sclerosis and human herpesvirus 6 active infection. Arch. Neurol. 2004; 61(10):1523–7.
14. Chapenko S, Trociukas I, Donina S, et al. Relationship between beta-herpesviruses reactivation and development of complications after autologous peripheral blood stem cell transplantation. J. Med. Virol. 2012; 84(12):1953–60. 

15. Cone RW, Huang ML, Hackman RC, Corey L. Coinfection with human herpesvirus 6 variants A and B in lung tissue. J. Clin. Microbiol .1996; 34(4):877–81. 

16. Pellett P.E., Ablashi D.V., Ambros P.F. et al. Chromosomally integrated human herpesvirus 6: questions and answers. Rev. Med. Virol. 2012; 22( 3) 144–55.
17. Nastke MD, Becerra A, Yin L et al. Human CD4+ T cell response to human herpesvirus 6. J. Virol. 2012;86:4776–4792
18. De Filippis L, Foglieni C, Silva S et al. Differentiated human neural stem cells: a new ex vivo model to study HHV-6 infection of the central nervous system. J Clin Virol. 2006;37(Suppl 1):27–32.
19. Gu B, Zhang GF, Li LY et al. Human herpesvirus 6A induces apoptosis of primary human fetal astrocytes via both caspase-dependent and -independent pathways. Virol J. 2011;8:530.
20. Mori Y, Seya T, Huang HL et al. Human herpesvirus 6 variant A but not variant B induces fusion from without in a variety of human cells through a human herpesvirus 6 entry receptor, CD46. J Virol. 2002;76:6750–6761
21. Tang H, Serada S, Kawabata A et al. CD134 is a cellular receptor specific for human herpesvirus-6B entry. Proc Natl Acad Sci USA. 2013;110:9096–9099.
22. Engdahl E., Gustafsson R., Huang J. et al. Increased Serological Response Against Human Herpesvirus 6A Is Associated With Risk for Multiple Sclerosis. Front. Immunol, 2019 p.2715.
23. https://patents.google.com/patent/JP2003135100A/en?oq=JP2003135100
24. Landegren U., et al. A Ligase-Mediated Gene Detection Technique// Science. – 1988. – Vol. 241. – P. 1077-1080
25. Griffin T. J., et al. Direct genetic analysis by matrix-assisted laser desorptiony/ionization mass spectrometry // Proc. Natl. Acad. Sci. – 1999. – Vol. 25. – P. 6301-6306
26. Wang D.G, et al. Large-Scale Identification, Mapping, and Genotyping of Single-Nucleotide Polymorphisms in the Human Genome // Science. – 1998 – Vol. 280. – P. 1077-1082
27. Saiki R.K., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science. – 1985. – Vol. 230. – No. 4732. – P. 1350-1354
28. Livak K.J., et al. 12 Oligonucleotides with Fluorescent Dyes at Ends Provide a Quenched Probe System Useful for Detecting PCR Product and Nucleic Acid Hybridization // PCR Wethods Appl. – 1995. – Vol. 4. – P. 357-362
29. Ririe K. M., et al. Product Differentiation by Analysis of DNA Melting Curves during the Polymerase Chain Reaction//Anal. Biochem. – 1997. – Vol. 245 – P. 154-160
30. Ведерников В.E., Никольский М.А., Вязовая A.A., Лиознов Д.А., Нарвская О.В. Способ идентификации вариантов А и В вируса герпеса человека 6-го типа. Патент РФ № 2627607; 2017.
31. https://patents.google.com/patent/CN103820574B/en.
32. Yavarian J, Shatizadeh Malekshahi S, Yavarian R, Yazdani S, Janani L, Shafiei Jandaghi NZ, Kiani SJ, Ahamadkhaniha H. Type specific Real time PCR for detection of human herpes virus 6 in schizophrenia and bipolar patients: a case control study. BMC Psychiatry. 2015 Nov 20; 15:296.
33. Isegawa Y., Mukai T., Nakano K. et al. Comparison of the complete DNA sequences of human herpesvirus 6 variants A and B. J. Virol. 1999;73(10):8053–63.
34. Мелехина Е.В., Домонова Э.А., Гоптарь И.А., Шипулина О.Ю., Горелов А.В. Первый в России случай наследственной передачи хромосомно-интегрированного вируса герпеса человека 6В (Human betaherpesvirus 6B). Вопросы практической педиатрии.  2019; 14(1):33–40. DOI: 10.20953/1817-7646-2019-1-33-40.
35. Домонова Э.А., Сильвейстрова О.Ю., Гоптарь И.А., Кулешов К.В., Пасхина И.Н., Никифорова А.В., Шипулина О.Ю., Маркелов М.Л., Шипулин Г.А., Малеев В.В. Первый случай выявления и лабораторного подтверждения наследственной передачи хромосомно–интегрированного Human betaherpesvirus 6А в Российской Федерации. Инфекционные болезни. 2019; 17(3): 5–14. DOI: 10.20953/1729-9225-2019-3-5-14.
36.  Borghesi A., Cipelletti P., Maragliano R., Manzoni P., Stronati M. Human herpesvirus-6 associated neonatal urticaria multiforme. Archives of Disease in Childhood - 2012. Fetal and Neonatal Edition, 98(5), F450–F450.
37. Никольский М.А., Вязовая А.А., Лиознов Д.А., Нарвская О.В., Смирнова Н.Н. Случай хромосомно-интегрированного вируса герпеса человека 6В типа у часто длительно болеющего ребенка. Журнал инфектологии. 2020;12(4):105-8.
38. Arbuckle J.H., Medveczky P.G. The molecular biology of human herpesvirus-6 latency and telomere integration. Microbes Infect. 2011; 13  (9): 731–41.
39. Мелехина Е.В., Лысенкова М.Ю., Свитич О.А., Музыка А.Д., Каражас Н.В., Рыбалкина Т.Н. и др. Особенности течения инфекции ВГЧ-6А и ВГЧ-6В у детей, проживающих в Московском регионе. Эпидемиол. инфекц. болезни. Актуал. вопр. 2018; (2):42–9.
40. Викулов Г.Х., Домонова Э.А., Мелехина Е.В., Сильвейстрова О.Ю., Кулешов К.В. Наследуемая хромосомная интеграция Humanbetaherpesvirus 6B у женщины с сочетанной герпесвирусной инфекцией, протекающей на фоне вторичной иммунной недостаточности. Инфекционные болезни. 2020; 18(4): 182–8. DOI: 10.20953/1729-9225-2020-4-182-188.