Обзор опубликован в журнале «Клеточная трансплантология и тканевая инженерия», том VII №4, 2012

сайт журнала –  http://celltranspl.ru/

Уфимцева А.И., Канов Е.В.

ООО «Транс-Технологии», Санкт-Петербург

192148, Санкт-Петербург, Железнодорожный проспект, д. 40

+7(812)677-47-28, aufimtceva@alkorbio.ru

Characterization and ex vivo expansion umbilical cord blood hematopoietic stem and progenitor cells

Ufimtceva A.I., Kanov E.V.

«Trans-Technologies Ltd», St. Petersburg

192148, St. Petersburg, Zheleznodorozhnyj prospekt, 40

+7(812)677-47-28, aufimtceva@alkorbio.ru

Пуповинная кровь, как один из альтернативных источников гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток, в настоящее время активно применяется в клинической практике. В связи с этим необходимо четко охарактеризовать содержащуюся в ней популяцию гемопоэтических предшественников и обнаружить среди них клетки с наибольшей способностью к восстановлению кроветворения. Кроме того, абсолютное количество гемопоэтических стволовых и кроветворных клеток в пуповинной крови невелико, что заставляет искать способы их наращивания ex vivo. В настоящее время разработан ряд методов характеристики прогениторных клеток пуповинной крови in vitro и in vivo и их экспансии ex vivo. В данном обзоре рассмотрены эти методы, а также проблемы их адаптации для практики клинической трансплантологии.

Ключевые слова: гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки, пуповинная кровь, методы характеризации, ex vivo экспансия.

Umbilical cord blood as an alternative source of hematopoietic stem and progenitor cells is widely used in clinical practice. Thereby it is necessary to characterize hematopoietic progenitors and to define among them the most primitive cells with the greatest repopulating potential. In addition absolute number of hematopoietic stem and progenitor cells is limited, so it is important to find ways of increasing their ex vivo. Currently several methods of in vitro and in vivo characterize hematopoietic progenitors and of ex vivo expansion of these cells have been developed. In this review we describe this methods, as well as problems with their translation to the clinical transplantation.

Key words: hematopoietic stem and progenitor cells, umbilical cord blood, methods of characterization, ex vivo expansion.

Введение

Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) - примитивные клетки, которые являются предшественниками всех форменных элементов крови и поддерживают кроветворение в костном мозге (КМ) на протяжении всей жизни организма. Известна также их способность восстанавливать гемопоэз летально облученного реципиента при трансплантации [1, 2]. Однако популяция ГСК неоднородна и содержит разные по степени зрелости и биологическим свойствам клетки. Наиболее примитивными из них являются длительно репопулирующие костный мозг ГСК (т.н. long term repopulating hematopoietic stem cells – LT-HSC). Также к ГСК относят и более зрелые клетки – кратковременно репопулирующие костный мозг ГСК (т.н. short term repopulating hematopoietic stem cells – ST-HSC) и мультипотентные прогениторные ГСК (т.н. multipotent progenitor hematopoietic stem cells – MPP-HSC) [3]. В связи с этим более корректным названием этой популяции является термин «гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки» (ГСК/ГПК). По мере дифференцировки MPP-HSC становятся либо общими лимфоидными предшественниками, из которых образуются Т и В лимфоциты и NK клетки, либо общими миелоидными предшественниками, которые, проходя промежуточные стадии, дают начало эритроцитарному, гранулоцитарному, моноцитарному и мегакариоцитарному росткам кроветворения [4].

Свойства ГСК/ГПК.

Для ГСК/ГПК, как и для всех стволовых клеток, характерна способность к самообновлению, т.е. делению с образованием своих идентичных копий, благодаря которому осуществляется поддержание пула ГСК/ГПК во взрослом организме [5]. Способность к самообновлению наиболее выражена у самых примитивных гемопоэтических клеток (LT-HSC) и уменьшается по мере дифференцировки [3].

Самообновление – один из вариантов судьбы ГСК/ГПК, помимо этого возможен уход клетки в дифференцировку с образованием коммитированных предшественников и, в дальнейшем, зрелых клеток крови, или гибель клетки путем апоптоза [5, 6]. Вероятность выбора каждого из вариантов не строго предопределена, а зависит от влияния множества внутриклеточных и внешних факторов [5]. За последние годы открыта роль ряда транскрипционных факторов во внутренней регуляции поведения ГСК/ГПК: например, в эмбриональном периоде это SCL, LMO2, GATA2, AML1, MYB; в гемопоэзе взрослого организма принимают участие HOX (в частности, HOXB4), Bmi1, Meis1, TEL, Gfi-1, MOZ и другие [3, 7, 8]. Также показано, что для выбора варианта развития ГСК/ГПК имеют значение эпигенетическая регуляция (например, модификация гистоновых белков с помощью ингибиторов деацетилаз), регуляция клеточного цикла (с помощью ингибиторов циклинзависимых киназ) и посттранскрипционная модификация белков для выбора варианта развития ГСК/ГПК [4]. Кроме того, большое количество экспериментальных данных свидетельствует о том, что в выборе судьбы гемопоэтических предшественников важную роль играет микроокружение [9]. Во взрослом организме ГСК/ГПК находятся в костном мозге, где негемопоэтические клетки и внеклеточный матрикс образуют для них так называемую нишу. Выделяют эндостальную нишу, образованную остеобластами, и сосудистую нишу, главную роль в которой играет эндотелий синусоидных капилляров [10, 11]. Внешняя регуляция дифференцировки и самообновления ГСК/ГПК осуществляется с помощью продуцируемых микроокружением биологически активных веществ [10] и непосредственных межклеточных взаимодействий [11]. Сегодня известно несколько сигнальных путей, задействованных в гемопоэзе, наиболее изученными из них являются пути, связанные с факторами Hedgehog, Wnt, Notch, FGF, BMP и Tie2-Angiopoietin1 [8, 10,12-15]. В настоящее время тщательно изучаются молекулярные механизмы выбора клеткой одного из путей развития для фармакологического воздействия на них in vitro и in vivo.

Другим присущим ГСК/ГПК свойством является их способность при внутривенном введении перемещаться в костномозговую нишу и восстанавливать кроветворение реципиента, т.е. способность к хомингу (англ. homing, от home – дом). На поверхности гемопоэтических предшественников обнаружен трансмембранный рецептор CXCR4 (C-X-C chemokine receptor type 4, по CD номенклатуре – CD184) [16], в то время как клетки стромы КМ экспрессируют его специфический лиганд – SDF-1 (stromal cell-derived factor 1, также называемый CXCL12) [17]. Ось SDF-1/CXCR4 играет ключевую роль в миграции ГСК/ГПК во взрослом организме [16]. Кроме того, в процессе хоминга задействованы интегрины VLA-4, VLA-5, LFA-1 и их лиганды VCAM-1 и ICAM-1 [18], а также рецептор СD44, который связывается с гиалуроновой кислотой [19]. Также гемопоэтические предшественники экспрессируют фермент дипептидил-пептидазу-4 (CD26), который расщепляет молекулу SDF-1, осуществляя негативную регуляцию хоминга [20]. На способности ГСК/ГПК к самообновлению и хомингу основано применение этих клеток в клинической практике.

Характеристика ГСК/ГПК.

Важной задачей современных исследований является характеристика гемопоэтических предшественников, которая необходима для понимания состава и биологических свойств ГСК/ГПК, а также для выделения примитивных субпопуляций с наибольшим пролиферативным и дифференцировочным потенциалом. Кроме того, четкая характеристика этих клеток важна при трансплантации для расчета клеточной дозы. На настоящий момент охарактеризовать ГСК/ГПК можно с помощью ряда in vitro и in vivo методов.

Одним из самых распространенных методов является фенотипирование гемопоэтических предшественников по поверхностным маркерам. Традиционно маркером человеческих ГСК/ГПК считается CD34 [21], также эти клетки слабо экспрессируют общий лейкоцитарный маркер CD45 (CD45^dim). На основе использования этих двух маркеров разработан протокол фенотипирования ГСК методом проточной цитометрии ISHAGE (International Society of Hematotherapy and Graft Engineering) для оценки количества CD34⁺ клеток в клинике [22]. Гемопоэтические предшественники также экспрессируют CD90 (Thy1) [23] и CD133 [24] и являются негативными по CD38 [25] и ряду маркеров, характерных для зрелых клеток крови – линейных маркеров (Lin^–). Особого внимания заслуживают ГСК/ГПК, не несущие CD34, но обладающие свойствами гемопоэтических предшественников восстанавливать кроветворение [26, 27]. Сравнение CD34⁺ и CD34^– клеток показало, что последние намного менее клоногенны in vitro [28], и, кроме того, при внутривенной трансплантации CD34^–/Lin^– клетки практически не приводят к репопуляции КМ реципиента [29], что связано с низким уровнем экспрессии CXCR4 и ограниченной способности к хомингу [30]. Однако данные клетки способны обеспечивать длительное восстановление всех ростков гемопоэза при внутрикостном введении [29, 31], а также давать начало CD34⁺ клеткам in vitro и in vivo [32]. Таким образом, считается, что CD34^–/Lin^– ГСК/ГПК являются примитивными гемопоэтическими предшественниками с высоким пролиферативным потенциалом. В последнее время ведется активный поиск новых позитивных маркеров ГСК/ГПК. В экспериментах на примитивных гемопоэтических предшественниках, полученных из КМ мышей, выявлены такие поверхностные молекулы, как CD105 (эндоглин) [33], CD201 (рецептор эндотелиального протеина С) [34] и CD150 (рецептор SLAM семейства) [35]. Однако для обнаружения аналогичных маркеров на человеческих ГСК/ГПК и определения их функций требуются дальнейшие исследования.

Помимо фенотипирования ГСК/ГПК путем определения на них поверхностных молекул, для характеристики этих клеток некоторые исследователи применяют так называемые функциональные тесты. Одним из таких тестов является определение способности клеток активно «выкачивать» из своей внутренней среды флюоресцентные красители, такие как Hoechst-33342 (Ho) и Rhodamine-123 (Rho), с помощью мембранных транспортеров семейства ABCG2 [36]. Клетки, способные к выраженному выведению красителя, и, как следствие, демонстрирующие низкую интенсивность флюоресценции при исследовании методом проточной цитометрии (Ho^low, Rho^low), называют SP-клетками (от англ. «side-population») [36, 37]. Важно, что эта популяция содержит значительное количество LT-HSC, которые обладают высоким пролиферативным потенциалом in vitro и in vivo [38, 39] и находятся в G₀ фазе клеточного цикла [40, 41]. Ещё одним функциональным тестом является определение активности внутриклеточной альдегиддегидрогеназы (ALDH) с использованием синтетического субстрата BODIPY®-аминоацетальдегида, способного к флюоресценции после взаимодействия с этим ферментом. Клетки с высокой активностью ALDH обладают свойствами ранних гемопоэтических предшественников [42, 43]. Кроме того, активность этого фермента коррелирует с колониеобразующей активностью in vitro и с приживлением при клинической трансплантации лучше, чем экспрессия CD34 [44, 45]. Таким образом, оценка способности клетки к «выкачиванию» флюоресцентных красителей и определение активности альдегиддегидрогеназы позволяют охарактеризовать наиболее примитивную субпопуляцию ГСК/ГПК, обогащенную LT-HSC.

Кроме определения поверхностных маркеров и постановки функциональных тестов для характеристики ГСК/ГПК существует также ряд культуральных методов. Критериями оценки гемопоэтических предшественников являются их способность к пролиферации и дифференцировке. Наиболее широко применяется методика с использованием полутвердых сред на основе метилцеллюлозы – исследование колониеобразования (colony-forming cells assay) [46]. Оценка осуществляется путем идентификации и подсчёта колоний с учетом их морфологии и времени появления. Этот метод характеристики ГСК/ГПК является обязательным для банков пуповинной крови [47]. Однако культуральные методы не позволяют судить о способности ГСК/ГПК к репопуляции КМ [15].

Более полную информацию о субпопуляциях ГСК/ГПК дают результаты исследований in vivo, при которых оценивается способность гемопоэтических предшественников заселять КМ облученного организма (marrow repopulating ability, MRA). Критериями оценки ГСК/ГПК являются длительность восстановления гемопоэза и его мультилинейность. Наиболее распространенная на настоящий момент методика – определение концентрации человеческих клеток, способных к заселению КМ NOD/SCID мышей (SCID-repopulating cells, SRC), методом предельных разведений [48-50]. Для этого кратные количества ГСК/ГПК вводят летально облученным животным и через 5-8 недель после трансплантации определяют процент человеческих CD45+ клеток или специфической ДНК в КМ реципиента. Но и по результатам этих исследований на лабораторных животных можно лишь косвенно судить о процессах восстановления гемопоэза у человека при трансплантации ГСК/ГПК.

Таким образом, характеристика гемопоэтических предшественников с помощью in vitro и in vivo методов чрезвычайно важна для изучения и применения этих клеток. Однако полную и достоверную информацию о поведении ГСК/ГПК в организме человека дают только результаты клинических исследований.

Благодаря открытию способности ГСК/ГПК восстанавливать кроветворение летально облученного реципиента при трансплантации стало возможным лечение состояний, связанных с подавлением собственного гемопоэза. Традиционным источником ГСК/ГПК является костный мозг, также гемопоэтические предшественники можно получить из пуповинной крови (ПК) и из периферической крови взрослого человека после мобилизации. Однако пуповинная кровь как источник ГСК/ГПК имеет ряд преимуществ: 1) ГСК/ГПК из ПК обладают большим пролиферативным потенциалом по сравнению с ГСК/ГПК из КМ [14, 51], что, вероятно, связано с большей длиной теломер [52]; 2) Т лимфоциты ПК функционально незрелые, что снижает вероятность и тяжесть реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) [53]; 3) подбор и получение необходимого для трансплантации образца происходит гораздо быстрее, чем подбор донора КМ; 4) при неродственной трансплантации менее строгие требования к совместимости по HLA; 5) процедура сбора ПК безболезненна и безопасна для донора; 6) низкая вероятность контаминации латентными вирусами, такими как цитомегаловирус и вирус Эпштейна-Барра [54-56].

Наиболее активно ПК используется в качестве альтернативного источника ГСК/ГПК при отсутствии донора КМ, совместимого по HLA. Было проведено сравнение исходов трансплантации несовместимых по 1-2 аллелям HLA образцов ПК (n=150) и КМ (n=83) взрослым пациентам [57]. Количество введенных ядросодержащих клеток (ЯСК) составляло 0,22×10⁸/кг для ПК и 2,2×10⁸/кг для КМ. Восстановление количества нейтрофилов после трансплантации ГСК/ГПК ПК в среднем наблюдалось к 27 дню, восстановление тромбопоэза – к 60 дню; у пациентов после трансплантации КМ – к 20 и 29 дню соответственно. Была отмечена схожая трехлетняя выживаемость в обеих группах (26% для ПК и 20% для КМ), однако частота острой РТПХ II-IV степени в первой группе была достоверно ниже (40% для ПК и 58% для КМ). Похожие результаты представлены и другими исследователями [51, 54, 56]. Таким образом, трансплантация ПК может заменить трансплантацию КМ при отсутствии совместимого донора.

Ex vivo экспансия ГСК/ГПК ПК: существующие подходы.

Необходимый этап всех методов экспансии – выделение популяции ГСК/ГПК. Для этого большинство исследователей применяют позитивную или негативную сортировку клеток с помощью моноклональных антител к специфическим маркерам с магнитными или флюорисцентными метками. В большинстве работ осуществляется позитивная сортировка CD34⁺ и/или CD133⁺ клеток [55], однако, при таком подходе из экспансии исключается популяция клеток, негативных по этим маркерам, но обладающих способностью к самообновлению и дифференцировке. Кроме того, есть данные, что связывание антител с поверхностными молекулами при позитивной сортировке может изменить функциональное состояние клетки [58], поэтому предпочтительной является негативная сортировка.

Для экспансии ГСК/ГПК необходимо создать условия для реализации их способности к самообновлению. Наиболее изученный подход - применение жидких бессывороточных сред с добавлением рекомбинантных человеческих цитокинов. Минимально необходимый набор цитокинов включает в себя фактор стволовых клеток (SCF), тромбопоэтин (TPO) и лиганд Fms-подобной тирозинкиназы 3 (Fms-related tyrosine kinase 3 ligand, Flt3L) [15, 59, 60]. Кроме того, показано значение интерлейкинов 3 и 6 (IL3, IL6) для ex vivo экспансии ГСК/ГПК [25, 61]. Однако разные исследователи используют разные комбинации этих цитокинов, дополнительно добавляя в культуру гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), фактор роста и развития мегакариоцитов (MGDF), эритропоэтин (EPO) также в различных сочетаниях [62-67]. Но для всех методик с использованием только цитокинов характерно лишь незначительное увеличение количества CD34⁺ клеток, в основном за счет более зрелых гемопоэтических предшественников. С этим связано более быстрое, но менее длительное восстановление гемопоэза при трансплантации ГСК/ГПК, полученных с помощью этих методик [15]. Кроме того, культивирование с цитокинами приводит к индукции апоптоза и снижению способности к хомингу [15].

На основании данных о роли негемопоэтических клеток КМ в самообновлении ГСК/ГПК in vivo многие авторы считают необходимым для их экспансии наличие фидерного слоя, состоящего из культуры стромальных клеток. С этой целью применяются клеточные линии, полученные из взрослых и эмбриональных кроветворных органов, таких как аорта-гонадо-мезонефрос, желточный мешок, фетальная печень и КМ [10]. Также ряд исследователей использует в качестве фидерного слоя ММСК [68-70] или полученные из них путем направленной дифференцировки остеобласты [71], создавая таким образом подобие эндостальной ниши in vitro. В настоящее время ведутся работы с целью выделения ММСК из ПК и использования их для экспансии гемопоэтических предшественников [72]. Для моделирования сосудистой ниши ГСК/ГПК возможно использование культуры эндотелиальных клеток пупочной вены (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) [73]. Одним из перспективных направлений ex vivo экспансии гемопоэтических предшественников является использование трехмерных матриц (например, из покрытого танталом пористого биоматериала Cytomatrix® [74] или полиэтилентерефталата с иммобилизованным фибронектином [75]). Некоторые исследователи комбинируют применение трехмерных структур, состоящих из нетканого пористого носителя и фидерного слоя клеток для более точного моделирования ниши ГСК/ГПК в КМ [76, 77]. Однако использование фидерного слоя является дорогостоящим и трудоемким; кроме того, применение ксеногенных клеток нежелательно при экспансии гемопоэтических предшественников для клинической трансплантации.

Исходя из накопленных данных о внутренней и внешней регуляции функций ГСК/ГПК in vivo, были разработаны новые подходы к наращиванию этих клеток в культуре. Такими подходами являются экспансия ГСК/ГПК с использованием ретиноевой кислоты [78], тетраэтиленпентамина (TEPA) - хелатора внутриклеточной меди [79], StemRegenin 1 – антагониста рецептора ароматических углеводородов [80], активация сигнального пути Notch с помощью лиганда Delta1 [81], применение рекомбинантных ангиопоэтин-подобных белков (в частности, Angptl5) [82]. Кроме того, к самообновлению и увеличению количества ГСК/ГПК приводит модификация гистоновых белков, которая достигается добавлением в культуру клеток ингибитора гистондеацетилаз никотинамида [83], вальпроевой кислоты – ингибитора GSK3β (гликоген синтазы киназы 3β) [84] или комбинации 5’аза-2’дезоксицитидина и трихостатина А [85]. Также для наращивания популяции гемопоэтических предшественников описано использование серотонина [86], плейотрофина [87] и паратиреоидного гормона [88]. Необходимо отметить, что все эти методики требуют, тем не менее, добавления цитокинов в питательную среду.

По сравнению с использованием только цитокинов, все вышеперечисленные методики приводят к более выраженной экспансии ГСК/ГПК. Так, например, добавление в культуру Angptl5 позволяет увеличить количество CD34⁺ клеток в 22 раза за 10 дней [82], использование иммобилизованного лиганда Delta1 – в среднем в 163 раза за 17-21 день [81], а применение StemRegenin1 – практически в 17000 раз за 35 дней [80]. Трансплантация полученных клеток NOD/SCID мышам также показывает увеличение количества SRC, но не столь значительное (в 20 раз при использовании Angptl5 [82], в 6,2 раз при применении Delta1 [81] и в 17,6 раз при экспансии со StemRegenin1 [80]). Однако сравнение этих результатов между собой затруднено из-за различий в постановке экспериментов и в методах оценки. Кроме того, разница между количеством CD34⁺ клеток и SRC указывает на необходимость использования дополнительных методов для характеристики ГСК/ГПС.

Ex vivo экспансия ГСК/ГПК ПК для клинического использования.

При выборе методики экспансии ГСК/ГПК с целью клинической трансплантации необходимо учитывать не только кратность увеличения числа гемопоэтических предшественников в эксперименте in vitro и их способность восстанавливать костномозговое кроветворение в эксперименте in vivo. Также требуется адаптировать протоколы экспансии для клинических масштабов и определить их безопасность для реципиента.

Для экспансии ГСК/ГПК в условиях эксперимента используют культуральные планшеты, флаконы или чашки Петри. Однако при культивировании больших объемов клеточной суспензии в статичных условиях встает проблема доставки питательных веществ и кислорода ко всем клеткам в культуре. Кроме того, необходим постоянный контроль концентрации кислорода и pH среды, т.к. эти показатели влияют на пролиферацию и дифференцировку ГСК/ГПК [89]. В связи с этим, для экспансии гемопоэтических предшественников с целью клинической трансплантации предложено применение биореакторов [89, 90]. В этих устройствах обеспечены постоянное перемешивание и оксигенирование питательной среды, а также возможен контроль ее pH и содержания кислорода. Помимо этого, использование биореакторов избавляет от необходимости манипуляций с многочисленными культуральными сосудами, что снижает риск контаминации культуры. Однако применение таких систем является очень дорогостоящим, требует больших объемов сред, высокой квалификации персонала и очень точного подбора условий культивирования. Поэтому более простой и распространенный метод экспансии ГСК/ГПК в клинических масштабах – использование газопроницаемых культуральных мешков [55, 66, 81, 91]. Такие мешки обеспечивают постоянный газообмен по всей поверхности и являются закрытой системой.

При экспансии ГСК/ГПК для клинического использования желательно избегать использования ксеногенных клеток и реагентов животного происхождения (в первую очередь, сывороток), так как это может привести к иммунному ответу со стороны реципиента. В связи с этим применяют бессывороточные питательные среды или среды на основе сыворотки крови человека, а также отказываются от фидерного слоя из ксеногенных клеточных линий или используют аутологичные клетки.

На настоящий момент проходят клинические испытания препаратов ГСК/ГПК ПК, полученных при экспансии с помощью некоторых из методик, перечисленных в разделе «Ex vivo экспансия ГСК/ГПК пуповинной крови: существующие подходы» [81, 91]. Так, например, компания Gamida Cell опубликовала результаты I/II фазы клинических испытаний препарата StemEx®, представляющего собой продукт экспансии ГСК/ГПК пуповинной крови с добавлением TEPA [91]. Образец ПК был разделен на две фракции, при этом из меньшей выделили CD133⁺ клетки с помощью магнитного сортера. Гемопоэтические предшественники культивировали в питательной среде αMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, цитокинов TPO, IL-6, Flt3L и SCF и TEPA. Экспансия проводилась в тефлоновых культуральных мешках в течение 21 дня. Полученные при экспансии клетки вводили через 24 часа после трансплантации большей некультивированной фракции того же образца. Количество ядросодержащих клеток в большинстве образцов составляло менее 2×10⁷/кг. В исследовании участвовало 10 пациентов с онкогематологическими заболеваниями, донорские образцы ПК имели несоответствия с реципиентами по 1-2 аллелям HLA. Среднее время восстановления количества нейтрофилов и тромбоцитов составило 30 и 48 дней соответственно, РТПХ III-IV степени выявлено не было, общая выживаемость на 100 день составила 90%. Все пациенты перенесли трансплантацию без осложнений.

Таким образом, экспансия ГСК/ГПК ПК может быть использована для увеличения количества гемопоэтических предшественников с целью клинического применения. Однако необходимо решить целый ряд технических задач для культивирования клеток в объемах, которые требуются для трансплантации. Кроме того, важен строгий контроль применяемых методик для обеспечения безопасности пациентов.

Изучение свойств гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток, а также возможностей их использования в клинике в настоящее время является актуальной и перспективной научной задачей. В качестве источника ГСК/ГПК на данный момент активно применяется пуповинная кровь. Она имеет ряд преимуществ перед другими источниками при наличии в образце необходимого количества гемопоэтических предшественников, способных к хомингу и заселению КМ. Для определения количества и свойств этих клеток существует ряд in vitro и in vivo методов, позволяющих охарактеризовать ГСК/ГПК и выделить среди этой неоднородной популяции клетки с наибольшим пролиферативным потенциалом, способностью мигрировать в КМ и длительно восстанавливать кроветворение реципиента. С этой целью активно изучается связь между фенотипом и функциональной активностью гемопоэтических предшественников in vitro и их поведением при экспериментальной и клинической трансплантации.

Основным недостатком ПК является небольшое абсолютное количество гемопоэтических предшественников. Для решения этой проблемы на основе накопленных знаний о механизмах самообновления и дифференцировки этих клеток разработан ряд методик для увеличения количества ГСК/ГПК без потери их биологических свойств. Однако необходимо проведение дальнейших исследований с целью адаптации этих методик для клинического применения, определения их эффективности и безопасности для пациентов.

Разработка методик характеристики и экспансии ГСК/ГПК является одной из приоритетных задач для банков ПК персонального хранения, так как это позволяет широко использовать криоконсервированный образец в клинической практике.

Литература 1. Thomas E.D., Lochte H.L. Jr, Lu W.C., Ferrebee J.W. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N Engl J Med. 1957; 257(11):491-6.

2. Till J.E., McCulloch E.A. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 1961; 14:213-22.

3. Forsberg E.C., Prohaska S.S., Katzman S., Heffner G.C., Stuart J.M., Weissman I.L. Differential expression of novel potential regulators in hematopoietic stem cells. PLoS Genet. 2005; 1(3):e28.

4. Schoemans H., Verfaillie C. Cellular biology of hematopoiesis. In: Hoffman R., Benz E.J. Jr, Shattil S.J., Furie B., Silberstein L.E., McGlave P., Heslop H., Anastasi .J, editors. Hematology: Basic Principles and Practice. 5th edn. Philadelphia: Elsevier Churchill Livingston. Part III, Chapter 20 p.358-371.

5. Alenzi F.Q., Alenazi B.Q., Ahmad S.Y., Salem M.L., Al-Jabri A.A., Wyse R.K. The haemopoietic stem cell: between apoptosis and self renewal. Yale J Biol Med. 2009; 82(1):7-18.

6. Zhu J., Emerson S.G. Hematopoietic cytokines, transcription factors and lineage commitment. Oncogene. 2002; 21(21):3295-313.

7. Dahl R., Hromas R. Transcription factors in normal and malignant hematopoiesis. In: Hoffman R., Benz E.J. Jr., Shattil S.J., Furie B., Silberstein L.E., McGlave P., Heslop H., Anastasi J., editors. Hematology: Basic Principles and Practice. 5th edn. Philadelphia: Elsevier Churchill Livingston. Part III, Chapter 21 p. 372-395.

8. Lessard J., Faubert A., Sauvageau G. Genetic programs regulating HSC specification, maintenance and expansion. Oncogene. 2004; 23(43):7199-209.

9. Haylock D.N., Nilsson S.K. Stem cell regulation by the hematopoietic stem cell niche. Cell Cycle 2005; 4:1353-5.

10. Zhang C.C., Lodish H.F. Cytokines regulating hematopoietic stem cell function. Curr Opin Hematol. 2008; 15(4):307-11.

11. Oh I.H., Kwon K.R. Concise review: multiple niches for hematopoietic stem cell regulations. Stem Cells. 2010; 28(7):1243-9.

12. Arai F., Hirao A., Ohmura M., Sato H., Matsuoka S., Takubo K., Ito K., Koh G.Y., Suda T. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 2004; 118(2):149-61.

13. Cerdan C., Bhatia M. Novel roles for Notch, Wnt and Hedgehog in hematopoesis derived from human pluripotent stem cells. Int J Dev Biol. 2010; 54(6-7):955-63.

14. Delaney C., Ratajczak M.Z., Laughlin M.J. Strategies to enhance umbilical cord blood stem cell engraftment in adult patients. Expert Rev Hematol. 2010; 3(3):273-83.

15. Hofmeister C.C., Zhang J., Knight K.L., Le P., Stiff P.J. Ex vivo expansion of umbilical cord blood stem cells for transplantation: growing knowledge from the hematopoietic niche. Bone Marrow Transplant. 2007; 39(1):11-23.

16. Peled A., Petit I., Kollet O., Magid M., Ponomaryov T., Byk T., Nagler A., Ben-Hur H., Many A., Shultz L., Lider O., Alon R., Zipori D., Lapidot T. Dependence of human stem cell engraftment and repopulation of NOD/SCID mice on CXCR4. Science. 1999; 283(5403):845-8.

17. Aiuti A., Webb I.J., Bleul C., Springer T., Gutierrez-Ramos J.C. The chemokine SDF-1 is a chemoattractant for human CD34+ hematopoietic progenitor cells and provides a new mechanism to explain the mobilization of CD34+ progenitors to peripheral blood. J Exp Med. 1997; 185(1):111-20.

18. Peled A., Kollet O., Ponomaryov T., Petit I., Franitza S., Grabovsky V., Slav M.M., Nagler A., Lider O., Alon R., Zipori D., Lapidot T. The chemokine SDF-1 activates the integrins LFA-1, VLA-4, and VLA-5 on immature human CD34(+) cells: role in transendothelial/stromal migration and engraftment of NOD/SCID mice. Blood. 2000; 95(11):3289-96.

19. Avigdor A., Goichberg P., Shivtiel S., Dar A., Peled A., Samira S., Kollet O., Hershkoviz R., Alon R., Hardan I., Ben-Hur H., Naor D., Nagler A., Lapidot T. CD44 and hyaluronic acid cooperate with SDF-1 in the trafficking of human CD34+ stem/progenitor cells to bone marrow. Blood. 2004; 103(8):2981-9.

20. Christopherson K.W. 2nd, Hangoc G., Broxmeyer H.E. Cell surface peptidase CD26/dipeptidylpeptidase IV regulates CXCL12/stromal cell-derived factor-1 alpha-mediated chemotaxis of human cord blood CD34+ progenitor cells. J Immunol. 2002; 169(12):7000-8.

21. Krause D.S., Fackler M.J., Civin C.I., May W.S. CD34: structure, biology, and clinical utility. Blood. 1996 Jan 1;87(1):1-13.

22. Sutherland D.R., Anderson L., Keeney M., Nayar R., Chin-Yee I. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International Society of Hematotherapy and Graft Engineering. J Hematother. 1996; 5(3):213-26.

23. Craig W., Kay R., Cutler R.L., Lansdorp P.M. Expression of Thy-1 on human hematopoietic progenitor cells. J Exp Med. 1993; 177(5):1331-42.

24. Yin A.H., Miraglia S., Zanjani E.D., Almeida-Porada G., Ogawa M., Leary A.G., Olweus J., Kearney J., Buck D.W. AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 1997; 90(12):5002-12.

25. Encabo A., Mateu E., Carbonell-Uberos F., Miñana M.D. CD34+CD38- is a good predictive marker of cloning ability and expansion potential of CD34+ cord blood cells. Transfusion. 2003; 43(3):383-9.

26. Zanjani E.D., Almeida-Porada G., Livingston A.G., Flake A.W., Ogawa M. Human bone marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multilineage expression that includes giving rise to CD34+ cells. Exp Hematol. 1998; 26(4):353-60.

27. Bhatia M., Bonnet D., Murdoch B., Gan O.I., Dick J.E. A newly discovered class of human hematopoietic cells with SCID-repopulating activity. Nat Med. 1998; 4(9):1038-45.

28. Goodell M.A., Rosenzweig M., Kim H., Marks D.F., DeMaria M., Paradis G., Grupp S.A., Sieff C.A., Mulligan R.C., Johnson R.P. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 1997; 3(12):1337-45.

29. Wang J., Kimura T., Asada R., Harada S., Yokota S., Kawamoto Y., Fujimura Y., Tsuji T., Ikehara S., Sonoda Y. SCID-repopulating cell activity of human cord blood-derived CD34- cells assured by intra-bone marrow injection. Blood. 2003; 101(8):2924-31.

30. Sonoda Y. Immunophenotype and functional characteristics of human primitive CD34-negative hematopoietic stem cells: the significance of the intra-bone marrow injection. J Autoimmun. 2008; 30(3):136-44.

31. Yahata T., Ando K., Sato T., Miyatake H., Nakamura Y., Muguruma Y, Kato S, Hotta T. A highly sensitive strategy for SCID-repopulating cell assay by direct injection of primitive human hematopoietic cells into NOD/SCID mice bone marrow. Blood. 2003; 101(8):2905-13.

32. Kimura T., Asada R., Wang J., Kimura T., Morioka M., Matsui K., Kobayashi K,, Henmi K., Imai S., Kita M., Tsuji T., Sasaki Y., Ikehara S., Sonoda Y. Identification of long-term repopulating potential of human cord blood-derived CD34-flt3- severe combined immunodeficiency-repopulating cells by intra-bone marrow injection. Stem Cells. 2007; 25(6):1348-55.

33. Chen C.Z., Li M., de Graaf D., Monti S., Göttgens B., Sanchez M.J., Lander E.S., Golub T.R., Green A.R., Lodish H.F. Identification of endoglin as a functional marker that defines long-term repopulating hematopoietic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99(24):15468-73.

34. Balazs A.B., Fabian A.J., Esmon C.T., Mulligan R.C. Endothelial protein C receptor (CD201) explicitly identifies hematopoietic stem cells in murine bone marrow. Blood. 2006; 107(6):2317-21.

35. Wagers A.J. Stem cell grand SLAM. Cell. 2005; 121(7):967-70.

36. Challen G.A., Little M.H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells 2006; 24:3.

37. Goodell M.A., Brose K., Paradis G., Conner A.S., Mulligan R.C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 1996; 183(4):1797-806.

38. Liu H., Verfaillie C.M. Myeloid-lymphoid initiating cells (ML-IC) are highly enriched in the rhodamine-c-kit(+)CD33(-)CD38(-) fraction of umbilical cord CD34(+) cells. Exp Hematol. 2002; 30:582.

39. McKenzie J.L., Takenaka K., Gan O.I., Doedens M., Dick JE: Low rhodamine 123 retention identifies long-term human hematopoietic stem cells within the Lin-CD34+CD38- population. Blood. 2007; 109:543.

40. Arai F., Hirao A., Suda T. Regulation of hematopoietic stem cells by the niche. Trends Cardiovasc Med. 2005; 15(2):75-9.

41. Pierre-Louis O., Clay D., Brunet de la Grange P., Blazsek I., Desterke C., Guerton B., Blondeau C., Malfuson J.V., Prat M., Bennaceur-Griscelli A., Lataillade J.J., Le Bousse-Kerdilès M.C. Dual SP/ALDH functionalities refine the human hematopoietic Lin-CD34+CD38- stem/progenitor cell compartment. Stem Cells. 2009; 27(10):2552-62.

42. Hess D.A., Meyerrose T.E., Wirthlin L., Craft T.P., Herrbrich P.E., Creer M.H., Nolta J.A. Functional characterization of highly purified human hematopoietic repopulating cells isolated according to aldehyde dehydrogenase activity. Blood. 2004; 104(6):1648-55.

43. Christ O., Lucke K., Imren S., Leung K., Hamilton M., Eaves A., Smith C., Eaves C. Improved purification of hematopoietic stem cells based on their elevated aldehyde dehydrogenase activity. Haematologica. 2007; 92(9):1165-72.

44. Lioznov M.V., Freiberger P., Kröger N., Zander A.R., Fehse B. Aldehyde dehydrogenase activity as a marker for the quality of hematopoietic stem cell transplants. Bone Marrow Transplant. 2005; 35(9):909-14.

45. Fallon P., Gentry T., Balber A.E., Boulware D., Janssen W.E., Smilee R., Storms R.W., Smith C. Mobilized peripheral blood SSCloALDHbr cells have the phenotypic and functional properties of primitive haematopoietic cells and their number correlates with engraftment following autologous transplantation. Br J Haematol 2003; 122: 99-108.

46. Yang H., Acker J.P., Cabuhat M., Letcher B., Larratt L., McGann L.E. Association of post-thaw viable CD34+ cells and CFU-GM with time to hematopoietic engraftment. Bone Marrow Transplant. 2005; 35(9):881-7.

47. International standards for cord blood collection, processing, testing, banking, selection, and release. 3rd Edn, 2006.

48. Nadali G., de Wynter E.A., Perandin F., Tavecchia L., Vincenzi C., Ambrosetti A., Fornalè M., Perona G., Pizzolo G., Testa N.G. Regulation of the proliferative potential of cord blood long-term culture-initiating cells (LTC-IC) by different stromal cell lines: implications for LTC-IC measurement. Haematologica. 1998; 83(12):1059-65.

49. Denning-Kendall P., Singha S., Bradley B., Hows J. Cobblestone area-forming cells in human cord blood are heterogeneous and differ from long-term culture-initiating cells. Stem Cells. 2003; 21(6):694-701.

50. Bhatia M., Wang J.C., Kapp U., Bonnet D., Dick J.E. Purification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating immune-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997; 94(10):5320-5.

51. Chao N.J., Emerson S.G., Weinberg K.I. Stem cell transplantation (cord blood transplants). Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2004; 354-71.

52. Gammaitoni L., Weisel K.C., Gunetti M., Wu K.D., Bruno S., Pinelli S., Bonati A., Aglietta M., Moore M.A., Piacibello W. Elevated telomerase activity and minimal telomere loss in cord blood long-term cultures with extensive stem cell replication. Blood. 2004; 103(12):4440-8.

53. Harris D.T., Schumacher M.J., Locascio J., Besencon F.J., Olson G.B., DeLuca D., Shenker L., Bard J., Boyse E.A. Phenotypic and functional immaturity of human umbilical cord blood T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992; 89(21):10006-10.

54. Rocha V., Gluckman E. Eurocord-Netcord registry and European Blood and Marrow Transplant group. Improving outcomes of cord blood transplantation: HLA matching, cell dose and other graft- and transplantation-related factors. Br J Haematol. 2009; 147(2):262-74. 55. Koestenbauer S., Zisch A., Dohr G., Zech N.H. Protocols for hematopoietic stem cell expansion from umbilical cord blood. Cell Transplant. 2009; 18(10):1059-68.

56. Gluckman E., Rocha V. Cord blood transplantation: state of the art. Haematologica. 2009; 94(4):451-4.

57. Laughlin M.J., Eapen M., Rubinstein P., Wagner J.E., Zhang M.J., Champlin R.E., Stevens C., Barker J.N., Gale R.P., Lazarus H.M., Marks D.I., van Rood J.J., Scaradavou A., Horowitz M.M. Outcomes after transplantation of cord blood or bone marrow from unrelated donors in adults with leukemia. N Engl J Med. 2004; 351(22):2265-75.

58. Gilner J.B., Walton W.G., Gush K., Kirby S.L. Antibodies to stem cell marker antigens reduce engraftment of hematopoietic stem cells. Stem Cells. 2007; 25(2):279-88.

59. Kobayashi M., Laver J.H., Lyman S.D., Kato T., Miyazaki H., Ogawa M. Thrombopoietin, steel factor and the ligand for flt3/flk2 interact to stimulate the proliferation of human hematopoietic progenitors in culture. Int J Hematol. 1997; 66(4):423-34.

60. Herrera C., Sánchez J., Torres A., Bellido C., Rueda A., Alvarez M.A. Early-acting cytokine-driven ex vivo expansion of mobilized peripheral blood CD34+ cells generates post-mitotic offspring with preserved engraftment ability in non-obese diabetic/severe combined immunodeficient mice. Br J Haematol. 2001; 114(4):920-30.

61. Zandstra P.W., Conneally E., Petzer A.L., Piret J.M., Eaves C.J. Cytokine manipulation of primitive human hematopoietic cell self-renewal. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997; 94(9):4698-703.

62. Berger M., Fagioli F., Piacibello W., Sanavio F., Mareschi K., Biasin E., Bruno S., Gammaitoni L., Gunetti M., Nesi F., Madon E., Aglietta M. Role of different medium and growth factors on placental blood stem cell expansion: an in vitro and in vivo study. Bone Marrow Transplant. 2002; 29(5):443-8.

63. Henschler R., Brugger W., Luft T., Frey T., Mertelsmann R., Kanz L. Maintenance of transplantation potential in ex vivo expanded CD34(+)-selected human peripheral blood progenitor cells. Blood. 1994; 84(9):2898-903.

64. Kobari L., Pflumio F., Giarratana M., Li X., Titeux M., Izac B., Leteurtre F., Coulombel L., Douay L. In vitro and in vivo evidence for the long-term multilineage (myeloid, B, NK, and T) reconstitution capacity of ex vivo expanded human CD34+ cord blood cells. Exp Hematol. 2000; 28(12):1470-80.

65. Donaldson C., Denning-Kendall P., Bradley B., Hows J. The CD34(+) CD38(neg) population is significantly increased in haemopoietic cell expansion cultures in serum-free compared to serum-replete conditions: dissociation of phenotype and function. Bone Marrow Transplant. 2001; 27(4):365-71.

66. Shpall E.J., Quinones R., Giller R., Zeng C., Baron A.E., Jones RB, Bearman SI, Nieto Y, Freed B, Madinger N, Hogan CJ, Slat-Vasquez V, Russell P, Blunk B, Schissel D, Hild E, Malcolm J, Ward W, McNiece IK. Transplantation of ex vivo expanded cord blood. Biol Blood Marrow Transplant. 2002; 8(7):368-76.

67. Mohamed A.A., Ibrahim A.M., El-Masry M.W., Mansour I.M., Khroshied M.A., Gouda H.M., Riad R.M. Ex vivo expansion of stem cells: defining optimum conditions using various cytokines. Lab Hematol. 2006; 12(2):86-93

68. Robinson S.N., Ng J., Niu T., Yang H., McMannis J.D., Karandish S., Kaur I., Fu P., Del Angel M., Messinger R., Flagge F., de Lima M., Decker W., Xing D., Champlin R., Shpall E.J. Superior ex vivo cord blood expansion following co-culture with bone marrow-derived mesenchymal stem cell. Bone Marrow Transplant. 2006; 37(4):359-66.

69. Wagner W., Roderburg C., Wein F., Diehlmann A., Frankhauser M., Schubert R., Eckstein V., Ho A.D. Molecular and secretory profiles of human mesenchymal stromal cells and their abilities to maintain primitive hematopoietic progenitors. Stem Cells. 2007; 25(10):2638-47.

70. Kadereit S., Deeds L.S., Haynesworth S.E., Koc O.N., Kozik M.M., Szekely E., Daum-Woods K., Goetchius G.W., Fu P., Welniak L.A., Murphy W.J., Laughlin M.J. Expansion of LTC-ICs and maintenance of p21 and BCL-2 expression in cord blood CD34+/CD38– early progenitors cultured over human mscs as a feeder layer. Stem Cells. 2002; 20(6):573-82.

71. Mishima S., Nagai A., Abdullah S., Matsuda C., Taketani T., Kumakura S., Shibata H., Ishikura H., Kim S.U., Masuda J. Effective ex vivo expansion of hematopoietic stem cells using osteoblast-differentiated mesenchymal stem cells is CXCL12 dependent. Eur J Haematol. 2010; 84(6):538-46.

72. Jang Y.K., Jung D.H., Jung M.H., Kim D.H., Yoo K.H., Sung K.W., Koo H.H., Oh W., Yang Y.S., Yang S.E. Mesenchymal stem cells feeder layer from human umbilical cord blood for ex vivo expanded growth and proliferation of hematopoietic progenitor cells. Ann Hematol. 2006; 85(4):212-25.

73. Yildirim S., Boehmler A.M., Kanz L., Möhle R. Expansion of cord blood CD34+ hematopoietic progenitor cells in coculture with autologous umbilical vein endothelial cells (HUVEC) is superior to cytokine-supplemented liquid culture. Bone Marrow Transplant. 2005; 36(1):71-9.

74. Ehring B., Biber T.M., Upton T.M., Plosky D., Pykett M., Rosenzweig M. Expansion of HPCs from cord blood in a novel 3D matrix. Cytotherapy. 2003; 5:490-499.

75. Feng Q., Chai C., Jiang X.S., Leong K.W., Mao H.Q. Expansion of engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells in three-dimensional scaffolds with surfaceimmobilized fibronectin. J Biomed Mater Res 2006; 78:781-791.

76. Takagi M., Iemoto N., Yoshida T. Effect of concentrations of murine stromal and hematopoietic cells on the progenitors expansion in their three-dimensional coculture in nonwoven fabrics. J Biosci Bioeng. 2002; 94(4):365-7.

77. Okamoto T., Takagi M., Soma T., Ogawa H., Kawakami M., Mukubo M., Kubo K., Sato R., Toma K., Yoshida T. Effect of heparin addition on expansion of cord blood hematopoietic progenitor cells in three-dimensional coculture with stromal cells in nonwoven fabrics. J Artif Organs. 2004; 7(4):194-202.

78. Purton L.E., Bernstein I.D., Collins S.J. All-trans retinoic acid delays the differentiation of primitive hematopoietic precursors (lin-c-kit+Sca-1(+)) while enhancing the terminal maturation of committed granulocyte/monocyte progenitors. Blood. 1999; 94(2):483-95.

79. Peled T., Landau E., Prus E., Treves A.J., Nagler A., Fibach E. Cellular copper content modulates differentiation and self-renewal in cultures of cord blood-derived CD34+ cells Br J Haematol. 2002; 116(3):655-61.

80. Boitano A.E., Wang J., Romeo R., Bouchez L.C., Parker A.E., Sutton S.E., Walker J.R., Flaveny C.A., Perdew G.H., Denison M.S., Schultz P.G., Cooke M.P. aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 2010; 329(5997):1345-8.

81. Delaney C., Heimfeld S., Brashem-Stein C., Voorhies H., Manger R.L., Bernstein I.D. Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of rapid myeloid reconstitution. Nat Med. 2010; 16(2):232-6.

82. Drake A.C., Khoury M., Leskov I., Iliopoulou B.P., Fragoso M., Lodish H., Chen J. Human CD34+ CD133+ hematopoietic stem cells cultured with growth factors including angptl5 efficiently engraft adult NOD-SCID Il2rc2/2 (NSG) mice. PLoS One. 2011; 6(4):e18382.

83. Trevis A., Peled T., Rosen O., inventors; Gamida-Cell Ltd., assignee. Ex-vivo expansion of hematopoietic stem cell populations in mononuclear cell cultures. AU patent 2005200679. 2005 Feb16.

84. De Felice L., Tatarelli C., Mascolo M.G., Gregorj C., Agostini F., Fiorini R., Gelmetti V., Pascale S., Padula F., Petrucci M.T., Arcese W., Nervi C. Histone deacetylase inhibitor valproic acid enhances the cytokine-induced expansion of human hematopoietic stem cells. Cancer Res. 2005; 65(4):1505-13.

85. Milhem M., Mahmud N., Lavelle D., Araki H., DeSimone J., Saunthararajah Y., Hoffman R. Modification of hematopoietic stem cell fate by 5aza 2'deoxycytidine and trichostatin A, Blood. 2004; 103(11):4102-10.

86. Yang M., Li K., Ng P.C., Chuen C.K., Lau T.K., Cheng Y.S., Liu Y.S., Li C.K., Yuen P.M., James A.E., Lee S.M., Fok T.F. Promoting effects of serotonin on hematopoiesis: ex vivo expansion of cord blood CD34+ stem/progenitor cells, proliferation of bone marrow stromal cells, and antiapoptosis. Stem Cells. 2007; 25(7):1800-6.

87. Himburg H.A., Muramoto G.G., Daher P., Meadows S.K., Russell J.L., Doan P., Chi J.T., Salter A.B., Lento W.E., Reya T., Chao N.J., Chute J.P. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat Med. 2010; 16(4):475-82.

88. Pirih F.Q., Michalski M.N., Cho S.W., Koh A.J., Berry J.E., Ghaname E., Kamarajan P., Bonnelye E., Ross C.W., Kapila Y.L., Jurdic P., McCauley L.K. Parathyroid hormone mediates hematopoietic cell expansion through interleukin-6. PLoS One. 2010; 5(10):e13657.

89. Kowalczyk M., Waldron K., Kresnowati P. Process challenges relating to hematopoietic stem cell cultivation in bioreactors. J Ind Microbiol Biotechnol. 2011; 38(7):761-7. 90. Nielsen L.K. Bioreactors for hematopoietic cell culture. Annu Rev Biomed Eng. 1999; 1:129-52

91. de Lima M., McMannis J., Gee A., Komanduri K., Couriel D., Andersson B.S., Hosing C., Khouri I., Jones R., Champlin R., Karandish S., Sadeghi T., Peled T., Grynspan F., Daniely Y., Nagler A., Shpall E.J. Transplantation of ex vivo expanded cord blood cells using the copper chelator tetraethylenepentamine: a phase I/II clinical trial. Bone Marrow Transplant. 2008; 41(9):771-8.