Автор: Надежда Сейлиева, руководитель группы разработки аллергочипа ГК Алкор Био

В 2012 году в Группе компаний Алкор Био, специализирующейся на выпуске наборов реагентов для лабораторной диагностики, стартовал проект по разработке и производству аллергокомпонентов. И в том же году на рынок был выпущен рекомбинантный аллерген пыльцы березы rBet v1. В 2013-14 гг. было получено семь аллергокомпонентов, а в первом полугодии 2015 года панель аллергокомпонентов, нативных и рекомбинантных, выпущенных на рынок, была расширена еще на четыре позиции и, в результате, общее число аллергокомпонентов производства ГК Алкор Био достигло двенадцати. В настоящее время «Алкор Био» - единственное предприятие в России, осуществляющее производство аллергокомпонентов для массового применения в клинической практике in vitro аллергодиагностики. Это - rPhl p 1 Тимофеевка (Phleum pratense), rPhl p 12 Тимофеевка (Phleum pratense), rPhl p 5 Тимофеевка (Phleum pratense), rBet v 1 Береза (Betula verrucosa), rBet v 2 Береза (Betula verrucosa), rBet v 4 Береза (Betula verrucosa), nArt v 1 Полынь  (Artemisia vulgaris), nArt v 3 Полынь  (Artemisia vulgaris), nBos d 6 БСА (бычий сывороточный альбумин), а также  аллергокомпоненты белка яйца nGal d 2 Овальбумин, nGal d 1 Овомукоид, nGal d 3 Кональбумин (овотрансферрин). Работы по расширению панели компонентов пыльцевых и пищевых аллергенов, как самых востребованных для диагностики аллергии, в ГК Алкор Био будут продолжены.

В конце 90-х для диагностики аллергии начали использовать отдельные аллергенные молекулы

Иммуноглобулины класса Е были открыты во второй половине XX века. Последующие исследования позволили определить роль иммуноглобулинов класса Е в развитии реакций гиперчувствительности 1-го типа. Была установлена значимость IgE опосредованного иммунного ответа в развитии большинства аллергических заболеваний.

На сегодняшний день диагностика аллергии и специфическая иммунотерапия основаны на применении экстрактов аллергенов. Экстракты аллергенов представляют собой сложные смеси, содержащие в составе помимо аллергенных белков, неаллергенные белковые молекулы и другие балластные вещества. В иммунологическом смысле аллерген - это антиген, способный связывать иммуноглобулины класса E. Аллергеном может называться источник аллергена (например, пыльцы березы), экстракт аллергенных белков или единственный аллергенный компонент из источника аллергена.

В конце 90-х годов для диагностики аллергии I типа вместо экстрактов аллергенов было предложено использовать отдельные аллергенные молекулы. Эта концепция получила название компонент-специфической диагностики, молекулярной или компонентной аллергодиагностики.

Индивидуальные аллергенные белки были названы «аллергокомпоненты».

Аллергокомпоненты могут быть получены как путем выделения из природных источников (натуральные высокоочищенные аллергены), так и при помощи молекулярно-биологических методов (рекомбинантные аллергены). Данные белки могут быть использованы для детальной оценки профиля чувствительности пациента к конкретному аллергену, а также проведения аллергоспецифической иммунной терапии (АСИТ). Исследования показали, что замещение натуральных экстрактов на панели аллергенных компонентов приведет к улучшению аналитических параметров тест-систем и может вывести in vitro аллергодиагностику на качественно новый уровень.

Основные термины и понятия. Структура, биохимические и физико-химические свойства аллергокомпонентов

Для описания частоты встречаемости аллергокомпонентов применяются термины «мажорные» и «минорные». Мажорные аллергокомпоненты это такие аллергенные молекулы, антитела к которым встречаются более чем у половины пациентов в популяции, реагирующей на данный источник. То есть аллергены с распространенностью более 50% называются мажорными, а менее 10% - минорными. Надо учитывать, что классификация аллергенов на мажорные и минорные полностью зависит от профиля сенсибилизации исследуемой популяции и аллергенных источников, преобладающих в данной географической области.

Сенсибилизация – специфически повышенная реактивность иммунной системы, обусловленная наличием аллергенспецифических антител и лимфоцитов (в том числе клеток иммунологической памяти), а также появлением и ростом представительства рецепторов различной аффинности для связывания аллергенспецифических антител в органах и тканях.

Для использования аллергокомпонентов в клинической практике и интерпретации результатов тестирования  необходимо знать классификацию компонентов, а также их свойства. По классификации Всемирной Организации Здравоохранения в обозначении названия аллергена участвуют первые три буквы рода, первая буква вида, арабская цифра обозначает порядок открытия аллергенной молекулы.

Например, Betula verrucosa - Bet v 1. Bet - род, v - вид, 1 - порядковый номер аллергена.

Для обозначения способа получения компонента перед названием ставится буква «r» (recombinant), если белок рекомбинантный и буква «n» (native), если он натуральный (например, nArt v 1).

Структура, биохимические и физико-химические свойства аллергена определяют иммунологические свойства. Важную роль в молекулярной структуре аллергена играют эпитопы - части антигена, напрямую взаимодействующие с антителом и способные в той или иной степени влиять на иммунную систему. С одной стороны, каждый вид имеет видоспецифичные аллергенные эпитопы, и антитела, полученные к этим структурам, связываются только с эпитопами данного конкретного вида. Видоспецифичные аллергенные компоненты являются первичными сенсибилизирующими молекулами, уникальными маркерами источника аллергенов. Определение таких компонентов означает выявление основного сенсибилизатора, вызывающего реакции только от одного источника.

С другой стороны, похожие по структуре белки часто представлены в близкородственных видах и даже филогенетически далеких группах растений и животных. Антитела, формирующиеся против таких структур, могут связываться с похожими белками других видов, являясь, таким образом, причиной кросс-реактивности. Выявление маркеров кросс-реактивности (перекрестной активности), дает ценную информацию о возможно нескольких сенсибилизирующих источниках.

Ещё одним важным свойством белка является его стабильность. Аллергены могут быть разделены на две группы: устойчивые к нагреванию и действию пищеварительных ферментов и не устойчивые. Аллергены, термически стабильные и способные сохранять свою иммуногенность после гидролиза пищеварительными ферментами, с наибольшей вероятностью будут вызывать тяжелые клинические реакции. В то время как неустойчивые к нагреванию и гидролизу аллергены, будут являться причиной мягких местных реакций или совсем не будут вызывать аллергических реакций, так как потеряют свои иммуногенные свойства в процессе пищеварения.

За два последних десятилетия было описано несколько белковых суперсемейств, представителей которых можно обнаружить в целом спектре природных источников. Так, большой интерес представляет мажорный аллерген пыльцы березы – Bet v 1, который относится к суперсемейству PR-10 (pathogenesis related protein). Данный белок обуславливает развитие специфической сенсибилизации более чем у 95% пациентов, страдающих от аллергии на пыльцу березы, которая, в свою очередь, является одной из самых распространенных причин развития ингаляционных форм аллергии. Белки суперсемейства PR-10 можно обнаружить в пыльце березы, пыльце лещины, яблоке, персике, моркови, арахисе, сое, киви и сельдерее. Высокая гомологичность белков обуславливает их значительное иммуногенное сходство, что является причиной проявления иммунологической кросс-реактивности аллергенов различной природы.

Классификация аллергокомпонентов

Таблица 1. Примеры первичных и перекрестно-реагирующих аллергокомпонентов

Аллергокомпоненты также были классифицированы по принадлежности к различным белковым семействам в соответствии с их функцией и структурой. В последние годы стало понятно, что большинство аллергокомпонентов принадлежат к ограниченному числу белковых семейств. Антитела IgE в одном белковом семействе часто проявляют кросс-реактивность и классификация аллергокомпонентов по белковым семействам может способствовать пониманию этого явления.

Классификация аллергокомпонентов по принадлежности к белковым семействам

1)   Неспецифические липид-переносящие белки (Non-specific lipid transfer proteins, nsLTPs)

Примеры: Ara h 9 (Арахис); Cor a 8 (Фундук); Pru p 3 (Персик); Par j 2 (Постенница); Art v 3 (Полынь)

Устойчивы к термической обработке. Вызывают реакцию на приготовленную пищу. Часто ассоциированы с системными и наиболее тяжелыми реакциями, с аллергическими реакциями на фрукты и овощи (кроме Art v 3 и Par j 2).

2)   Запасные белки (Storage proteins)

Примеры: Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 6, Ara h 7 (Арахис); Ber e 1 (Бразильский орех); Gly m 5, Gly m 6 (Соя); Cor a 9 (Фундук); Tri a 19 (Пшеница)

Присутствуют в семенах и орехах. Служат питательными веществами для роста растения. Термически устойчивы, вызывают реакции, в том числе и приготовленном виде.

3)   Патогенез-связанные белки (Pathogenesis-related protein family 10, PR-10)

Примеры: Bet v 1 (Береза); Ara h 8 (Арахис); Gly m 4 (Соя); Cor a 1 (Фундук); Pru p 1 (Персик); Api g 1 (Сельдерей); Mal d 1 (Яблоко); Dau c 1 (Морковь)

Термически не устойчивы. После термической обработки в процессе приготовления теряют свои иммуногенные свойства.

Белки, относящиеся к семейству PR-10 также называются Bet v 1-гомологи и часто связаны с локальными симптомами, такими как оральный аллергический синдром к фруктам и овощам. Могут предрасполагать к аллергическим реакциям на фрукты семейства розоцветных, фундуку, моркови, сельдерею.

4)   Профилины (Profilins)

Примеры: Bet v 2 (Береза); Phl p 12 (Тимофеевка); Pru p 4 (Персик); Hev b 8 (Латекс)

Актин-связывающие белки показывают высокую гомологию и кросс-реактивность между филогенетически далекими видами. Считаются минорными аллергенами растений. Профилины редко ассоциированы с клиническими симптомами, но могут являться причиной тяжелых реакций у небольшого числа пациентов. Сенсибилизация к профилинам может привести к множественным положительным результатам при тестировании на экстрактах пыльцы растений, однако в большинстве случаев это имеет низкую клиническую значимость.

5)   Перекрестно-реагирующие карбогидратные детерминанты (Cross-reactive carbohydrate determinants, CCD)

Примеры: CCD MUFX3 Ana c 2 (Ананас, Бромелайн)

Могут быть использованы как маркеры к белковым карбогидратным фрагментам (пыльца, перепончатокрылые насекомые). Редко ассоциированы с клиническими реакциями, но могут вызывать аллергические реакции у ограниченного числа пациентов.

6)   Кальций-связывающие белки (Calcium-binding proteins)

Примеры: Bet v 4 (Береза); Phl p 7 (Тимофеевка)

Высоко кросс-реагирующие белки представлены в пыльце растений, но отсутствуют в растительной пище.

7)   Сывороточные альбумины (Serum albumins)

Примеры: Fel d 2 (Кошка); Can f 3 (Собака); Bos d 6 (Молоко, Говядина); Ecu c 3 (Лошадь)

Широко представлены в различных биологических жидкостях и тканях. Содержатся в молоке коровьем, говядине, яйцах и курином мясе. Сенсибилизация к сывороточным альбуминам может привести к реакциям дыхательных путей на млекопитающих животных, а также пищевые реакции на молоко и мясо.

8)   Парвальбумины (Parvalbumis)

Примеры: Cyp c 1 (Карп); Gad c 1 (Треска)

Основные аллергены рыбы. Также являются маркерами кросс-реактивности среди различных видов рыб и амфибий. Парвальбумины устойчивы к нагреванию и гидролизу ферментами желудочно-кишечного тракта, поэтому вызывают аллергические реакции, в том числе на приготовленную пищу.

9)   Тропомиозины (Tropomyosins)

Примеры: Pen a 1 (Креветка); Der p 10 (Dermatophagoides pteronyssinus); Ani s 3 (Аскарида)

Актин-связывающие белки мышечных фибрилл. Могут использоваться как маркеры кросс-реактивности между ракообразными, клещами, тараканами и нематодами.

10)  Липокалины (Lipocalins)

Примеры: Fel d 1, Fel d 4 (Кошка); Can f 1, Can f 2 (Собака); Ecu c 1 (Лошадь); Mus m 1 (Домовая мышь)

Стабильные белки и важные аллергены животных. Аллергокомпоненты, принадлежащие к семейству липокалинов, являются маркерами кросс-реактивности.

Особенности и применение компонентной диагностики. Прогноз тяжести аллергических реакций

Куриные яйца являются важным компонентом в питании человека и в то же самое время одним из основных пищевых аллергенов. Многие развитые страны вводят обязательное обозначение яиц в составе пищевых продуктов. Аллергия к яйцу одна из наиболее часто распространенных пищевых аллергий у детей до трех лет. Среди обследованных детей с атопическим дерматитом около 35,5% имеют аллергию к яйцу, тогда как среди взрослых с аллергией к пище около 12% реагируют на яйца.

Примерно 80% от общего белка, содержащегося в курином яйце, составляют 4 аллергена: овомукоид (Gal d 1, 11%), овальбумин (Gal d 2, 54%), кональбумин, также известный под названием овотрансферрин (Gal d 3, 12%) и лизоцим (Gal d 4, 3%).

Овомукоид - основной аллерген белка яйца. Это сильно гликозилированный белок, устойчивый к протеазам и  термической обработке, способный сохранять свои иммуногенные свойства даже после обработки при 100°С в течение часа.

Овальбумин является фосфорилированным гликопротеином, в четыре раза превышающим по количеству овомукоид.  Это ещё один значимый аллерген, термически устойчивый белок, иммуногенность которого, по некоторым данным, снижается после воздействия высоких температур.

Кональбумин (ион связывающий гликопротеин) и лизоцим (гликозидаза), который часто встречается в составе многих продуктов из-за своих антибактериальных свойств, не устойчивы к термической обработке. Таким образом, определение антител к овомукоиду и овальбумину позволяет врачу определить необходимость назначения строгой диеты.

Таблица 2. Прогноз частоты и тяжести клинических симптомов на примере наличия или отсутсвия IgE к экстракту «Яичный белок», f1 и компоненту белка яйца «nGald1 Овомукоид», f68

Специфическое лечение аллергических заболеваний. Прогноз эффективности АСИТ

На данный момент, аллерген-специфическая терапия может быть предложена только пациентам с аллергией на пыльцу, несмотря на то, что постоянно ведутся исследования специфической иммунотерапии пищевой аллергии. Молекулярная аллергодиагностика позволяет прогнозировать эффективность АСИТ для пациентов, имеющих специфические IgE к суммарному экстракту аллергена.

АСИТ будет эффективной в случае наличия специфических IgE к мажорным компонентам аллергена и отсутствии к минорным. В случае выявления специфических IgE к экстракту, (например, t3 «береза»), определение специфических антител к компонентам (Bet v 1, Bet v 2, Bet v 4) позволяет прогнозировать эффективность аллергоспецифической иммунотерапии.

Прогноз эффективности АСИТ на примере тестирования компонентов аллергенов пыльцы березы, t3 приведен ниже. В пыльце березы мажорным компонентом является Bet v 1, а минорными – Bet v 2 и Bet v 4 (см. Таблица 3)

Таблица 3. Прогноз эффективности АСИТ, береза

Эффективность АСИТ будет высокой для пациентов, имеющих IgE только к Bet v 1. В случае наличия специфических IgE как к мажорному, так и к минорным компонентам, эффективность будет средней. АСИТ будет малоэффективна в случае отсутствия IgE к мажорному компоненту.

Аналогичный прогноз можно дать для пациентов, имеющих IgE к экстракту g6, «тимофеевка». В пыльце тимофеевки мажорными компонентами являются два компонента Phl p 1 и Phl p 5, а минорными – Phl p 7 и Phl p 12.

Таблица 4. Прогноз эффективности АСИТ, тимофеевка

Эффективность АСИТ будет высокой для пациентов, имеющих IgE только к мажорным аллергокомпонентам Phl p 1 и Phl p 5. В случае наличия специфических IgE как к мажорным, так и к минорным компонентам, эффективность будет средней. АСИТ будет малоэффективна в случае отсутствия IgE к мажорным компонентам Phl p 1 и Phl p 5.

Применение и преимущества компонентной аллергодиагностики

Одним из наиболее важных клинических применений молекулярной диагностики аллергии является её способность выявлять аллергены, к которым пациенты сенсибилизированы, в том числе первичные или видоспецифичные аллергены, а также маркеры перекрестной активности. Определение того, вызвана ли сенсибилизация первичным, видоспецифичным компонентом (истинная сенсибилизация), или перекрестно реагирующим, позволяет оценить риск развития аллергической реакции при воздействии различными источниками аллергенов.

Понимание структуры белка, принадлежности к белковому семейству, а также термостабильности и устойчивости к гидролизу, позволяет врачу прогнозировать переносимость различных пищевых продуктов, прогнозировать эффективность АСИТ и степень тяжести клинических реакций.

Внедрение практики применения аллергенных компонентов в лабораторной in vitro аллергодиагностике будет способствовать повышению специфичности и воспроизводимости проводимых анализов, а также получению знаний об индивидуальном профиле чувствительности пациента для назначения правильной и своевременной терапии.

Статья опубликована:

http://www.inpharm.ru/komponentnaya-allergodiagnostika-osobennosti-i-preimushhestva

http://www.medlinks.ru/article.php?sid=64426