Журнал"Лаборатория"№4,2012,с.16-19

Павлов А.Е.^1,2, Апалько С.В.¹, Воробьев Е.В.¹

(1. ООО «Вега» Группа компаний «Алкор Био», Санкт-Петербург; 2. Санкт-Петербургский Государственный Университет, Санкт-Петербург.)

Муковисцидоз (МВ) — генетическое аутосомно-рецессивное моногенное заболевание, обусловленное мутацией гена муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости (CFTR). Заболевание характеризуется нарушением секреции экзокринных желез жизненно важных органов с поражением прежде всего дыхательного и желудочно-кишечного тракта, тяжелым течением и неблагоприятным прогнозом [1].

Для  раннего начала лечения МВ, которое обеспечит более высокий терапевтический эффект и улучшит прогноз заболевания с возможностью продлить жизнь больного до 30 – 45 лет, необходима ранняя диагностика (первые недели после рождения). С этой целью в большинстве развитых стран мира введены программы по массовому скринингу новорожденных. Согласно Европейскому консенсусу целью неонатального скрининга МВ является выявление как можно большей доли пациентов с МВ на доклинической стадии с минимальным количеством ложных результатов и при минимальных затратах. [3]. Это может быть достигнуто путем использования различных протоколов скрининга.

С 2006 г. в ряде регионов России, а с 1 января 2007 г. в рамках национального приоритетного проекта «Здоровье» во всех субъектах МВ был включен в перечень наследственных заболеваний, подлежащих обязательному неонатальному скринингу, наряду с фенилкетонурией, галактоземией, гипотиреозом и адреногенитальным синдромом . Тем не менее, диагностика заболевания все еще остается не на должном уровне. По данным Российского центра муковисцидоза, в котором наблюдаются дети до 18 лет, возраст, в котором впервые был установлен диагноз МВ, в среднем по России составил 30,3 месяца, по Москве – 23,0 месяца, тогда как в странах Западной Европы и Северной Америки этот показатель равняется 11,0 месяцам. При развитии у большинства пациентов клинической картины заболевания уже на первом году жизни диагноз в этом возрасте устанавливался только у трети из них. [4].

Одной из основных причин позднего выявления МВ является принятая в РФ схема скрининга. Протокол скрининга включает 4 этапа [5, 6]: иммунореактивный трипсиноген (ИРТ), ре-тест по ИРТ, потовый тест и ДНК–диагностику, – причем только первые три являются обязательными. На первом этапе, как и во всем мире, определяется уровень биохимического маркера - ИРТ в сухом пятне крови новорожденного. Анализ берется на 4–5-й день у доношенных и на 7–8-й день у недоношенных новорожденных. Пороговым является уровень ИРТ 70 нг/мл, показатели, превышающие его, считаются положительными. Повышение в первую неделю жизни в крови ИРТ является весьма чувствительным (85–90%), но не специфичным признаком. Поэтому необходим второй этап обследования повторный анализ на ИРТ (ре-тест) на 21–28-й день жизни, позволяющий исключить здоровых детей,. При концентрации маркера более 40 нг/мл, проводится потовая проба, которая является ключевым компонентом скрининга на МВ в России. При отрицательном результате потовой пробы (менее 40 ммоль/л) ребенок в течение первого года жизни наблюдается по месту жительства с диагнозом «неонатальная гипертрипсиногенемия» для исключения случаев гиподиагностики. В случае пограничных результатов потового теста (40–60 ммоль/л) потовую пробу следует повторить, а также провести ДНК-диагностику. При положительном результате потовой пробы, а также при обнаружении мутаций гена CFTR (в случае пограничного результата потовой пробы) ребенку ставится диагноз МВ. Для постановки окончательного диагноза потовый тест должен быть положительным не менее трех раз. В сомнительных случаях могут помочь дополнительные методы обследования (анализ кала на панкреатическую эластазу 1, микроскопическое копрологическое исследование, компьютерная томография или рентгенография органов грудной клетки, посев мазка из зева). Следует отметить, что на всех этапах скрининга могут быть получены как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты. Ложноположительные результаты ИРТ отмечаются при синдроме Эдвардса, асфиксии в родах, глубокой недоношенности и т.д. Ложноотрицательные результаты ИРТ могут определяться при внутриутробной инфекции, почечной недостаточности, некоторых хромосомных заболеваниях, поражениях поджелудочной железы, а также несоблюдении требований к взятию образца крови.  Потовая проба, признанная «золотым стандартом» в диагностике МВ, также не обеспечивает абсолютную точность в постановке диагноза. По данным Российского центра МВ, среди больных до 18 лет положительный потовый тест отмечался у 89,2%, пограничные цифры – у 10,3%, а отрицательный потовый тест у 0,5% [6].

Основной причиной получения ложноотрицательных результатов ДНК-диагностики МВ в России является неудовлетворительное качество используемых наборов. Диагностические наборы, представленные на российском рынке, определяют не более 14 мутаций в гене CFTR  и требуют осуществления трудоемкой процедуры. Информативность таких систем не превышает 80% случаев больных МВ. Исходя из вышесказанного, ни один из перечисленных методов сам по себе не является достаточным для постановки диагноза МВ или связанных с мутациеми в гене CFTR нарушений. Существующая на территории РФ схема скрининга на МВ не позволяет получать надежные достоверные результаты на доклинической стадии развития заболевания. В настоящее время в мире насчитывается около 15 вариантов программ по скринингу новорожденных, включающих от 2 до 4 последовательных этапов обследования.

Из Таблицы 1 следует, что во многих странах вторым подтверждающим тестом является ДНК-диагностика. Такой подход приводит к  повышению чувствительности до 91% и сокращению сроков постановки диагноза и, соответственно, более раннему проведению терапии [7]. 

Таблица 1. Схемы обязательных этапов неонатального скрининга на МВ, применяемые в разных странах [2]. 

На данный момент известно более 1700 мутаций, обуславливающих развитие симптомов МВ, которые имеют разную частоту встречаемости и тяжесть клинических проявлений [8]. Мутации гена CFTR могут быть объединены в четыре группы в соответствии с прогнозируемыми клиническими последствиями: мутации, приводящие к развитию МВ; к развитию нарушений, связанных с функциональными дефектами белка CFTR; мутации без установленных последствий и мутации, имеющие недоказанную или неопределенную клиническую значимость. Широкий спектр мутаций гена CFTR, их сравнительно невысокая частота и популяционная гетерогенность создают объективные трудности в разработке протоколов проведения ДНК-диагностики МВ и проведения генетического консультирования среди населения, относящегося к разным этническим группам и проживающего в разных регионах.

При анализе документов, посвященных использованию ДНК-диагностики в скрининге МВ [6, 11-14], были выделены следующие рекомендации к тесту:

1. В диагностическую панель должны быть включены мутации из списка, рекомендованного ACMG, частота встречаемости которых у больных МВ составляет не менее 0.1 %;

2. Диагностическая панель должна быть дополнена расовыми/этническими специфическими мутациями, наиболее общими для изучаемой популяции;

3. В диагностическую панель, главным образом, должны быть внесены мутации, относящиеся к I группе, т.е. вызывающие МВ с сильным фенотипическим проявлением;

4. Диагностическая тест-система должна находиться в ценовой категории, доступной для проведения массового скрининга;

5. Специфичность диагностической тест-системы должна составлять, по крайней мере, 85 - 95%;

6. Чувствительность диагностической тест-системы должна позволять анализировать небольшие количества ДНК, выделенной из образцов сухих пятен крови;

7. Анализ должен быть пригодным для рутинного скрининга с адекватным временем производительного цикла;

8. Интерпретация полученных результатов должна быть простой и недвусмысленной;

9. Воспроизводимость диагностической тест-системы должна быть 100%;

10. Доступность необходимого инструментария для проведения анализа.

В декабре 2005 Food and Drug Administration (FDA) был одобрен первый коммерческий молекулярно-генетический диагностический тест на определение МВ для клинического использования. В России на данный момент не существует молекулярно-генетического диагностического набора, прошедшего регистрацию в Росздравнадзоре, отвечающего всем выше перечисленным требованиям и готового к применению в клинической диагностике. В связи с этим особую ценность приобретает разработанный компанией Алкор Био тест «Муковисцидоз-БиоЧип» для клинической диагностики мутаций в гене CFTR, адаптированный для применения на территории РФ и стран СНГ. 

Формат диагностического набора «Муковисцидоз-БиоЧип»

На первом этапе разработки диагностического теста нами была определена панель мутаций. Критериями выбора мутаций служили – частота встречаемости в славянской популяции, тяжесть фенотипических проявлений, а также рекомендации, консолидированные из европейских и американских источников [11-14], и известных российских работ [6]. Для проведения молекулярно-генетического тестирования по отобранной панели мутаций было предложено использовать принцип анализа на биочипе (microarray) путем обратной гибридизации флуоресцентно меченых зондов.

Нанесение и иммобилизация мишеней.

В качестве твердой фазы для иммобилизации мишеней было использовано функционализированное предметное стекло с реакционной поверхностью. Конструирование и синтез олигонуклеотидных мишеней было выполнено с учетом включения дикого и мутантного варианта полиморфизма. Нанесение проб с мишенями на фазу было выполнено бесконтактным способом на роботе для печати микрочипов Piezorray (PerkinElmer) согласно топологической схеме.

Пробоподготовка.

В качестве источника геномной ДНК для проведения анализа могут быть использованы - венозная кровь, буккальный эпителий или сухие пятна крови. Для получения надежных результатов метод выделения должен обеспечивать не менее 10 нг ДНК в концентрации не менее 1 нг/мкл. Подходящим вариантом является метод выделения ДНК на основе спиртового соосаждения, например, набор «Экстра-ДНК-Био» (Алкор Био).

Наработка флуоресцентных зондов.

Синтез меченых зондов для гибридизации на микрочипе производится в ходе двух раундов полимеразной цепной реакции (ПЦР). На первом этапе 12 пар праймеров, объединенных в 5 пулов и имеющих специфичность к мутантным участкам гена CFTR, используются для наработки промежуточных длинных ампликонов (ПЦР1). В ходе второго раунда ПЦР (ПЦР2) используется значительный избыток Cy5-меченых праймеров для наработки преимущественного одноцепочечного продукта с мишеней ПЦР1. Продукт реакции ПЦР2 представляет собой смесь меченых зондов, специфичных к исследуемым участкам ДНК.

Гибридизация.

Инкубация микрочипа с мечеными зондами, разведенными в буфере, может быть выполнена на специализированной гибридизационной станции для микрочипов (Tecan), либо в оригинальной пластиковой камере на водяной бане при температуре 50°С в течение 1,5 часов.

Считывание результатов.

Биочип из набора «Муковисцидоз-БиоЧип» совместим со всеми сканерами для чипов (ScanArray G_x (PerkinElmer), MArS (Ditabis) и PowerScanner (Tecan)) стандартного размера 75х25х1 мм. Настройки сканера (мощность лазера, коэффициент усиления, разрешение) устанавливаются индивидуально. Для снижения вероятности ошибки поле анализа представлено на биочипе в четырех повторах. 

Результаты апробации набора«Муковисцидоз-БиоЧип»

Панель мутаций.

На основании проведенного анализа, нами были отобрано 25 мутаций в гене CFTR, вызывающих МВ с сильным фенотипическим проявлением и имеющих сравнительно высокую частоту встречаемости в европейской и славянской популяциях (табл. 2). 

Таблица 2.

Мутации в гене CFTR, включенные в панель «Муковисцидоз-БиоЧип».

По сравнению с другими тест-системами для генотипирования мутаций CFTR в нашу панель не включены следующие мутации:

·                    3120+1G>A – мутация имеет африканское происхождение и не встречается у европеоидной расы. Выявлена в Южной Африке, Саудовской Аравии и Греции.

·                    R117H – вызывает слабый и «плавающий» фенотип. Эффект мутации зависит от длины политимидинового участка в 8-ом интроне.

·                    A445E, R560T, 3659delC, 711+1G>T, 1898+1G>A, 2184delA, I148T – имеют низкую частоту встречаемости. Могут быть рекомендованы для включения в расширенную панель чипа для проведения скрининга.Панель включает в себя мутацию Dele2-3, являющуюся второй по частоте и характерной преимущественно для славянской популяции.

Предлагаемая панель позволит выявлять до 96% всех больных, что значительно превосходит эффективность существующих на данный момент генетических тест-систем, которые обычно включают определение 11 – 14 мутаций.

Пробоподготовка.

Два последовательных раунда ПЦР, в ходе которых нарабатываются меченые зонды, обеспечивают высокую чувствительность метода (от 10 нг геномной ДНК). Для органичного включения молекулярно-генетического анализа в принятую схему тестирования на МВ нами был разработан протокол выделения ДНК из сухих пятен крови. Набор «Экстра-ДНК-Био» (Алкор Био) позволяет выделять геномную ДНК в достаточном количестве и необходимой чистоты из трех дисков сухого пятна крови диаметром 3,2 мм.

Проведение анализа.

Разработанные праймеры и общая схема постановки анализа позволяют в последнем раунде ПЦР наработать полную популяцию аллель-специфических меченых зондов. В ходе последующей гибридизации смесь зондов инкубируется с биочипом. Проведение двух раундов амплификации и последующая гибридизация на чипе требует около 4,5 часов. Анализ сканированного изображения может быть выполнен как визуально по предложенной схеме, так и с использованием специального программного обеспечения. Результатом тестирования является заключение о наличии либо отсутствии мутантных аллелей гена и генотипе пациента.

Верификация.

Определение аналитических свойств тест-системы было выполнено на референсных образцах ДНК. Для 16-ти из 25-ти мутаций были использованы образцы из собственного генетического банка. Оставшиеся 9 редких вариантов были проанализированы с использованием искусственно синтезированных генных конструкций, содержащих  мутантные аллели и эквимолярные количества геномной ДНК «дикого типа».

Анализ результатов тестирования показал полное совпадение генотипов, полученных набором реагентов «Муковисцидоз-БиоЧип» с ожидаемыми генотипами референсных образцов.

Апробация.

Проведение апробации тест-системы было выполнено совместно с Медико-генетическим диагностическим центром Санкт-Петербурга (МГЦ). Всего было проанализировано 76 «слепых» образцов, из них: 72 образца - выделенная ДНК, 1 сухое пятно крови, 3 образца замороженной крови. Все изученные образцы имели данные о генотипе, полученные другими молекулярно-генетическими методами.В результате апробации генотипы были подтверждены для 72 образцов, диагноз по 4 образцам не совпал. Проанализировав причины расхождения, нами были сделаны следующие выводы: 1 образец - очень редкая мутация, которая не входит в панель биочипа; 2 и 3 образцы- возможно перепутаны при фасовке, требуется дополнительная проверка; 4 образец - в МГЦ не был определен, но обнаружен набором «Муковисцидоз-БиоЧип». 

Заключение

Несмотря на то, что с 2007 г. во всех субъектах РФ в рамках национального приоритетного проекта «Здоровье» внедрен массовый скрининг новорожденных на МВ, до настоящего времени сохраняется проблема ранней диагностики заболевания. Это во многом обусловлено применяемой в России схемой скрининга, в которой этап ДНК-диагностики, одного из самых специфичных тестов, находится на последнем месте и не является обязательным. На Соласительной конференции [18] были приняты основные рекомендации по использованию и интерпретации анализа мутаций при МВ в клинических условиях. На российском рынке на данный момент не представлено ни одного ДНК-теста на МВ, соответствующего выработанным требованиям и пригодного для клинического использования. ДНК-тесты, рекомендованные FDA, не подходят для использования в российской популяции из-за отсутсвия в панели некоторых регион-специфических мутаций.

Тест-система «Муковисцидоз-БиоЧип» предназначена для единовременного определения 25 наиболее часто встречающихся на территории РФ мутаций, связанных с развитием тяжелого фенотипа этого заболевания, с помощью метода ДНК-микрочипов с использованием методов мультиплексной ПЦР и флюоресцентной детекции.

Основные характеристики диагностического набора «Муковисцидоз-БиоЧип»:

- разработанная панель включает список мутаций, рекомендованных ACMG, и мутации специфические для российской популяции. Представленный набор позволит выявлять больных МВ в 95% случаев;

- формат биочипа позволяет сократить время анализа (общее время анализа 10 образцов на 25 мутаций одним лаборантом - около 6-7 часов);

- формат биочипа при аккуратном исполнении всех этапов работ снижает вероятность контаминации за счет отсутствия стадии электрофореза;- чувствительность набора позволяет анализировать от 10 нг ДНК. Геномная ДНК может быть получена из сухих пятен крови, цельной крови либо буккального эпителия;

На данный момент диагностический набор «Муковисцидоз-БиоЧип» прошел технические и клинические испытания и находится на финальной стадии получения регистрационного удостоверения. Появление зарегистрированного диагностического набора на МВ на российском рынке, позволит скорректировать схему неонатального скрининга с выведением ДНК-диагностики на второй этап тестирования или ее проведении параллельно с ИРТ тестом. «Муковисцидоз-БиоЧип» может быть использован для неонатального скрининга, в том числе в рамках приоритетного национального проекта «Здоровье», в клинической молекулярно-генетической и пренатальной диагностике, для скрининга муковисцидоза при планировании семьи, а также для диагностики мужского бесплодия. 

Подчеркиваем, что диагноз муковисцидоз может быть поставлен врачом только по совокупности указывающих на это признаков: клинические проявления, оценка функциональной активности белка CFTR и генотип.

Замена ре-теста ИРТ на генетический анализ позволит снизить вероятность ложного диагностирования, увеличить скорость постановки диагноза и уменьшить общие затраты на алгоритм неонатального скрининга.  

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.      Консенсунс по муковисцидозу. Медицинская газета, 1995, № 41, 02.06.95.

1. Толстова В.Д., Чумакова О.В., Капранов Н.И., Каширская Н.Ю., Ходунова А.А., Денисенкова Е.В. Результаты и перспективы скрининга новорожденных на муковисцидоз в рамках приоритетного национального проекта. Вопросы практической педиатрии 2008; 3 (3): 63-67.
2. Castellani C, Southern KW, Brownlee K. et al. European best practice guidelines for cystic fibrosis neonatal screening. Journal of Cystic Fibrosis 2009; 8: 153–173.
3. Southern K.W., Munck A., Pollit R., Castellani C., et al. A survey of newborn screening for cystic fibrosis in Europe. J of Cystic Fibrosis 2007; 6: 57–65.
4. Толстова В.Д., Каширская Н.Ю., Капранов Н.И. Массовый скрининг новорожденных на муковисцидоз в России. Фарматека 2008; 1: 1–5.
5. Муковисцидоз. Современные достижения и актуальные проблемы. Методические рекомендации. Издание третье (первое 2001) переработанное и дополненное. Под редакцией Капранова Н.И., Каширской Н.Ю. М.: ООО «4ТЕ Арт». 2008. – с.124.
6. Comeau A.M., Parad R.B., Dorkin H.L., et al. Population-based newborn screening for genetic disorders when multiple mutation DNA testing is incorporated: a CF newborn screening model demonstrating increased sensitivity but more carrier detections. Pediatrics 2004; 113(6): 1573–1581.
7. Cystic Fibrosis Mutation Database : [www.genet.sickkids.on.ca]. URL: http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/
8. Grody WW, Cutting GR, Klinger KW, Richards CS, Watson MS, Desnick RJ. Laboratory standards and guidelines for population-based cystic fibrosis carrier screening. Subcommittee on Cystic Fibrosis Screening, Accreditation of Genetic Services Committee, ACMG. American College of Medical Genetics. Genet Med 2001; 3:149–154.
9. Watson MS, Cutting GR, Desnick RJ, Driscoll DA, Klinger K,Mennuti M, et al. Cystic fibrosis population carrier screening: 2004 revision of American College of Medical Genetics mutation panel. Genet Med 2004; 6:387–391.

1. Castellani C., Cuppens H., Macek M. Jr. et al. Consensus on the use and interpretation of cystic fibrosis mutation analysis in clinical practice. J Cyst Fibr. 2008; 7:179-196.
2. Schwarz M., Gardner A., Jenkins L. et al. Testing Guidelines for molecular diagnosis of Cystic Fibrosis. Clin Mol Genet Soc. 2009.
3. 32^nd European CF Conference, 10-13 June 2009. Brest, France.
4. Иващенко Т.Э., Баранов В.С. Биохимические и молекулярно-генетические основы патогенеза муковисцидоза // СПб, Интермедика, 2002, 256 с.
5. Dequeker E., Stuhrmann M., Morris MA. et al. Best practice guidelines for molecular genetic diagnosis of cyctic fibrosis and CFTR-related disorders-updated European recommendations. Eur J Hum Genet. 2009; 17:51-65.
6. Estivill E., Bancells C., Ramos C. et al. Geographic distribution and regional origin of 272 cystic fibrosis mutations in European populations. Hum Mutat. 1997; 10:135-154.
7. Консенсус по использованию и интерпретации анализа мутаций при муковисцидозе в клинической практике. Европейское общество муковисцидоза. 2008 г. Материал опубликован Elsevier B.V.