Григорьева Тамара Дмитриевна, к.м.н., высшая категория, врач КДЛ, ГКДЦ (вирусологический)

Фалилеева Марина Юрьевна, высшая категория, врач КДЛ, ГКДЦ (вирусологический)

Горохова Анастасия Игоревна, врач КДЛ, ГКДЦ (вирусологический)

Клиническая инфекционная больница им. С.П. Боткина, Санкт-Петербург, Россия

Информация о распространении коронавируса SARS-CoV-2, вызывающего заболевание COVID-19, впервые появилась в конце декабря прошлого года. Очагом инфекции стал китайский город Ухань. За несколько месяцев болезнь охватила более 210 стран мира. 11 марта Всемирная организация здравоохранения объявила пандемию коронавируса.

Коронавирусы (Coronaviridae) – это большое семейство РНК-содержащих вирусов с одноцепочечной положительно заряженной молекулой РНК, способных инфицировать человека и некоторых животных. У большинства пациентов с COVID-19 имеются слабые клинические проявления или симптомы средней тяжести, но у примерно15% больных развивается тяжелая пневмония, а у около 5% - острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) и полиорганная недостаточность. Смертность при COVID-19 колеблется от 1 до 5%, наиболее тяжелые формы развиваются у пациентов пожилого возраста с сопутствующими заболеваниями сердечно-сосудистой системы, почек, печени, сахарным диабетом и др. [2, 3, 4]. При острых признаках заболевания исследуют мазки из зева методом ПЦР, который выявляет генетический материал возбудителя (РНК) и подтверждает диагноз.

Выявление антител класса IgG к SARS-CoV-2 важно, прежде всего,  для оценки иммунного статуса при коронавирусной инфекции.

Иммуноглобулины G (IgG) синтезируются последними, через 5-6 недель с момента попадания вируса в организм, и сохраняют информацию о коронавирусе. Обычно IgG являются архивом памяти перенесеных инфекций, в большинстве случаев пожизненно, либо на несколько лет. Механизмы развития иммунной реакции на коронавирус пока изучаются. Неясно, стойкий иммунитет формируется или нет. Это предстоит узнать. Но в любом случае, выявление IgG свидетельствует о факте попадания коронавируса в организм и иммунном ответе организма.

Для детекции IgG к SARS-CoV-2 в настоящее время используется множество тест-ситем, зарегистрированных в РФ. Это тест-системы, основанные на иммунохроматографическом методе (экспресс-тесты), методе  ИХЛА  и методе ИФА.

Лаборатории чаще подтверждают скрининговые исследования зарубежными тестами ("Рош Диагностикс ГмбХ", Германия, "Эбботт Ирландия, Диагностическое подразделение" Ирландия), а для выявления работают с тестами российских производителей. Соответствие  диагностических характеристик, заявленным в инструкции,  и  удобство с точки зрения лаборанта - основные требования, предъявляемые  к тестам при большой загруженности лаборатории.

В настоящее время в медицинском и лабораторном профессиональном сообществе огромное значение придается точности анализов биологических жидкостей. Строгое соблюдение инструкций производителя, несомненно, способствует повышению качества диагностики. Большое внимание уделяется системам внешней оценки качества исследований, однако, по современным научным данным, известно, что использование результатов внешнего контроля качества не всегда возможно из-за появления т.н. матричных эффектов, существующих во многих материалах, используемых для внешнего контроля. Как правило, материалы, используемые для контроля качества, подвергаются ряду обработок (заморозка, лиофилизация,  добавление посторонних веществ), поэтому ведут себя не так, как свежие образцы биологических жидкостей, анализируемые в рутинной практике. Таким образом, появляется феномен матрикс-эффектов, включающий в себя взаимодействие четырех компонентов: прибора-анализатора, состава реагентов, самого метода, а также способа обработки и состава аналитов и контрольных материалов.

Существует способ оценки матрикс-эффекта, основанный на том, что соотношение между наблюдаемым ответом (результатом исследования) и фактической концентрацией вещества зависит от условий окружающей среды (в том числе, матрикса) во время процесса исследования. Величину возможного матрикс-эффекта можно оценить по степени разброса результатов, полученных двумя сравнимыми методами в случае использования репрезентативной выборки аликвот пациентов. Для выполнения данного сравнительного анализа можно использовать обычно используемый (часто используемый) метод для данного вида исследования.

Целью данной работы была оценка возможного матрикс-эффекта при использовании Набора реагентов для качественного и полуколичественного иммуноферментного определения иммуноглобулинов G к коронавирусу SARS-CoV-2 в сыворотке и плазме крови человека «SARS-CoV-2ИФА-IgG», производства компании Алкор Био.

Материалы и методы:  Нами были исследованы сыворотки 93 пациентов на наличие IgG-антител к коронавирусу SARS-CoV-2. В качестве тест-системы сравнения использовался Набор реагентов «SARS-CoV-2-IgG-ИФА-БЕСТ», применяемый в рутинной лабораторной практике.

В наборе «SARS-CoV-2ИФА-IgG» производства Алкор Био  использован вариант непрямого, двустадийного твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта рекомбинантный белок, соответствующий закодированному в геноме вируса белку, иммобилизован на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок). Во время первой инкубации происходит связывание специфических иммуноглобулинов, содержащихся в исследуемом образце, с антигеном твердой фазы. Несвязавшиеся компоненты удаляются промывкой. Во время второй инкубации антитела к иммуноглобулинам G человека, конъюгированные с пероксидазой хрена, связываются с иммунокомплексом, образовавшимся на первой стадии. Несвязавшиеся компоненты удаляются промывкой. Во время инкубации с раствором ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству иммуноглобулинов G в исследуемых пробах. Наличие IgG оценивается относительно значения индекса позитивности.

Результаты сравнительного определения IgG-антител к  коронавирусу SARS-CoV-2 в лаборатории СПб ГБУЗ «Больница Боткина» ГКДЦ (вирусологический) представлены в Таблице 1. Сравнительная таблица коэффициентов позитивности определения IgG-антител к к коронавирусу SARS-CoV-2.

*коэффициент позитивности

Дополнительно были исследованы 83 отрицательных образца. Значимых расхождений в результатах исследования сывороток крови пациентов на наличие иммуноглобулинов G к коронавирусу SARS-CoV-2 при использовании тест-систем вышеуказанных производителей, получено не было.  Таким образом, влияние матрикса при использовании Набора реагентов для качественного и полуколичественного иммуноферментного определения иммуноглобулинов G к коронавирусу SARS-CoV-2 в сыворотке и плазме крови человека «SARS-CoV-2ИФА-IgG», производства компании Алкор-Био, доказано не было.

Как видно из приведенной таблицы, значимых расхождений в результатах исследования сывороток крови пациентов на наличие иммуноглобулинов G к коронавирусу SARS-CoV-2 при использовании тест-систем вышеуказанных производителей, получено не было.  Таким образом, влияние матрикса при использовании Набора реагентов для качественного и полуколичественного иммуноферментного определения иммуноглобулинов G к коронавирусу SARS-CoV-2 в сыворотке и плазме крови человека «SARS-CoV-2ИФА-IgG», производства компании Алкор-Био, доказано не было.

Также при использовании данной тест-системы нами был отмечен ряд преимуществ, а именно:

1. Короткий по времени цикл ручной постановки (1 час 20 минут);

2. Цветная окраска контрольных проб, аналитического буфера, конъюгата;

3. Изменение цвета аналитического буфера при внесении испытуемого образца (со светло-зеленого на голубой), что исключает пропуск лунки или неправильное внесение образца;

4. При определении титров антител предусмотрено разведение образцов с КП ≥6,6;

5. Наличие в инструкции производителя таблицы пересчета КП в титры АТ для образцов, разведенных в 10 раз. Возможность выдавать ответ в КП или титрах антител;

6. Стабильность окраски в лунках планшета до 20 минут (удобно в случае невозможности измерения ОП сразу после остановки ферментативной реакции);

7. Отсутствие этапа предварительного разведения сывороток, что исключает ошибки при разведении и внесении образцов в рабочий планшет;

8. Возможность адаптации протокола исследования для постановки на автоматических ИФА-анализаторах открытого типа;

Таким образом, без предварительного разведения сывороток в 100 раз набор показывает достоверные результаты.

Набор реагентов для качественного и полуколичественного иммуноферментного определения иммуноглобулинов G к коронавирусу SARS-CoV-2 в сыворотке и плазме крови человека «SARS-CoV-2ИФА-IgG» производства компании Алкор Био, может быть рекомендован к использованию в рутинной лабораторной практике.

Список литературы:

1. Louis Grandjean, et al. // Humoral Response Dynamics Following Infection with SARS-CoV-2. // medRxiv, 2020, DOI:  10.1101/2020.07.16.20155663

2. Xiang-Yang Yao, et al. // Neutralizing and binding antibody kinetics of COVID-19 patients during hospital and convalescent phases. // medRxiv, 2020, DOI:  10.1101/2020.07.18.20156810

3. Ania Wajnberg, et al. // Robust neutralizing antibodies to SARS-CoV-2 infection persist for months. // Science, 2020: eabd7728, DOI: 10.1126/science.abd7728

4.  Daniel F. Gudbjartsson, et al. // Humoral Immune Response to SARS-CoV-2 in Iceland. // NEJM, 2020, ; 383:1724-1734, DOI: 10.1056/NEJMoa2026116

5. Guillaume Beaudoin-Bussières, et al. // Decline of Humoral Responses against SARS-CoV-2 Spike in Convalescent Individuals // mBio, 2020; DOI:  10.1128/mBio.02590-20

6. МЗ РФ. Временные методические рекомендации "Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19). Версия 9 (26.10.2020)". С. 33-36