Статьи

17 июня 2013

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА NGS В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ СКРИНИНГА НОВОРОЖДЕННЫХ

Журнал "Российский вестник перинатологии и педиатрии" №2 2013г. том 58

Смирнов А.М., Зайцева М.А., Павлов А.Е.*

Секвойя дженетикс (Sequoia genetics), ГК Алкор Био, Санкт-Петербург

*Автор для корреспонденции: apavlov@sequoiag.com, +7 812 6776535

РЕЗЮМЕ

Развитие технологий молекулярно-генетического анализа привело к созданию перспективного метода секвенирования следующего поколения (next generation sequencing, NGS). Постоянное снижение себестоимости и увеличение производительности данного метода, а также повышение точности анализа, уже позволяют задумываться о возможности его применения в клинической практике. Поскольку генетический анализ важен в ранней диагностики многих наследственных болезней, подбора индивидуальной терапии, а также для лучшего понимания этиологии многих заболеваний, развитие методов ДНК-диагностики приобретает большую актуальность. Особый интерес с точки зрения ДНК-диагностики представляют собой моногенные заболевания, некоторые их которых включены в список обязательного тестирования новорожденных в разных странах. Для многих из них (муковисцидоз, фенилкетонурия, галактоземия, адреногенитальный синдром) известны мутации, ассоциированные с развитием заболевания, что позволяет использовать ДНК-диагностику для подтверждения диагноза уже после проведения первого скринингового обследования, в пренатальной диагностике, а также при планировании семьи.

Разработка и внедрение клинических решений для проведения точной и исчерпывающей генодиагностики на базе технологий NGS представляет большой интерес именно в случае моногенных заболеваний, т.к. данные об обнаруженных генетических вариантах могут быть непосредственно интерпретированы врачом-генетиком при получении положительных или пограничных результатов неонатального скрининга.  

Ключевые слова: неонатальный скрининг, NGS, генетическая диагностика, планирование семьи.

ОБЗОР 

Во многих странах проводится неонатальный скрининг на заболевания, диагностика которых особенно важна в первые месяцы жизни. Список тестируемых заболеваний значительно отличается в разных странах и даже в разных регионах одной страны, но, как правило, в панели включены заболевания, ранняя терапия которых значительно улучшает качество жизни пациента [1]. В США программы неонатального скрининга формируются на уровне штатов и обычно включают несколько десятков заболеваний [2], в странах Европы число тестируемых заболеваний варьирует от 1 до 29 [1]. В России проводится скрининг на муковисцидоз, фенилкетонурию, галактоземию, адреногенитальный синдром и врожденный гипотиреоз. Для четырех из пяти заболеваний установлена выраженная генетическая составляющая, что позволяет проводить генетическое тестирование, выявляя, таким образом, больных и носителей заболеваний. Схемы проведения скрининга также могут отличаться и, как правило, состоят из нескольких этапов, где ДНК тестирование обычно присутствует, но часто не является обязательным [1]. В частности, во многих европейских странах при скрининге на муковисцидоз ДНК-диагностика применяется на втором этапе тестирования, в то время как в России поиск мутаций обычно осуществляется в последнюю очередь и не регламентируется методическими указаниями. Несмотря на различия в программах неонатального скринига в разных странах, очевидно, что ДНК-диагностика играет важную роль в подтверждении диагноза, и с развитием методов генетического анализа эта позиция будет только усиливаться. В течение последних десятилетий основным методом прямого анализа нуклеотидной последовательности ДНК был автоматизированный метод секвенирования по Сэнгеру. Однако возможности этого метода ограничиваются максимальной длиной прочтения около 1000 нуклеотидов, следовательно, он не подходит для рутинного секвенирования протяженных регионов генома. Кроме того, данный метод достаточно трудоемкий и дорогостоящий при его введении, как обязательного этапа тестирования. Развитие технологий анализа ДНК привело к разработке методов секвенирования следующего поколения, или next-generation sequencing (NGS), главное преимущество которых состоит в их высокой производительности. Стоимость секвенирования продолжает снижаться, и это дает основание предполагать, что в ближайшем будущем эта методика может стать рутинной процедурой в молекулярно-генетических центрах и будет широко использоваться для целей клинической диагностики и персонализированной медицины [3, 4].

Принципиальным отличием метода NGS от так называемого капиллярного секвенирования, или секвенирования по Сэнгеру, является массовое параллельное прочтение огромного количества относительно небольших фрагментов ДНК. На данный момент на рынке представлено несколько различных NGS-платформ, однако в основе большинства технологий лежит общий алгоритм постановки анализа. Сначала анализируемую ДНК обрабатывают для создания так называемых библиотек, представляющих собой фрагменты ДНК, предназначенные для секвенирования. Затем эти фрагменты подвергаются клональной амплификации для получения «матрицы» для секвенирования, после чего следует непосредственно прочтение нуклеотидной последовательности [5]. К настоящему моменту технология NGS позволила снизить стоимость секвенирования индивидуального генома человека до 5 тыс. долларов США. Однако, по-прежнему довольно высокая стоимость, а также сложность обработки получаемых данных препятствуют широкомасштабному внедрению полногеномного секвенирования в клиническую диагностику в ближайшее время. Существенно больший интерес в данный момент представляет так называемый метод таргетного NGS ресеквенирования, заключающийся в фокусировки аналитического потенциала технологии в пределах заданных «регионов интереса». Благодаря использованию референсного генома значительно облегчается процесс обработки данных NGS, и снижаются требования к объему и качеству получаемых данных. Для целевого исследования генома в пределах интересующих регионов на этапе приготовления библиотек применяется метод таргетного обогащения, позволяющий наработать только те фрагменты ДНК, которые необходимо проанализировать для данного пациента. Разработано большое количество методик таргетного обогащения, основанных на двух разных принципах: ПЦР (полимеразной цепной реакции) и гибридизационного захвата [6, 7]. При использовании ПЦР происходит специфичная амплификация целевых регионов в геноме, после чего из продуктов амплификации получают библиотеки для секвенирования. Во многих работах продемонстрировано успешное использование метода таргетного NGS ресеквенирования, основанного на ПЦР, для поиска мутаций, приводящих к развитию генетических заболеваний [8, 9]. Методика гибридизационного захвата основана на принципах специфической гибридизации фрагментов анализируемой ДНК с синтезированными зондами заданной последовательности на твердой или в жидкой фазе. Одним из применений данного метода является экзомное секвенирование – определение белок-кодирующей последовательности генома [10, 11]. Экзомное секвенирование используется при диагностике генетических заболеваний неясной этиологии [12], а также при дифференциальной диагностике раковых опухолей [13]. Наибольший интерес в диагностике методом таргетного секвенирования представляют менделевские (моногенные) заболевания с значительным количеством редких клинических мутаций, встречающихся в популяции. Анализ подобных генов с помощью классических молекулярных методов  затруднен, поскольку они позволяют анализировать фиксированное количество мутаций и обладают ограниченными возможностями мультиплексирования (Табл. 1).

Таблица 1. Сравнение распространенных методов анализа последовательности ДНК.

 

Мультиплексность
(анализ большого количества маркеров)
Производительность
(анализ большого количества образцов)
Стоимость (при пересчете на количество анализируемых маркеров) Возможность обнаружения неизвестных мутаций
ПЦР (различные модификации) Низкая Средняя Низкая Нет
Микрочипы Высокая Низкая Высокая Нет
Капиллярное секвенирование (по Сэнгеру) Высокая Низкая Высокая Есть
NGS Очень высокая Очень высокая Низкая Есть

Основные преимущества NGS по сравнению с другими методами молекулярно-генетического анализа:

  1. Возможность идентификации новых вариантов. Традиционные методы генетического анализа (например, ПЦР, микрочипы) позволяют выявлять хотя и большое, но все же ограниченное количество мутаций. Поэтому редкие варианты, обычно не входящие в панель исследуемых генетических маркеров в большинстве методов, останутся не обнаруженными. Например, в гене муковисцидоза на данный момент известно чуть менее 2000 мутации, из них более 100 являются патогенными [14]. В то же время, существующие методы позволяют однозначно выявлять не более 30 мутаций.
  2. Высокая производительность. В отличие от капиллярного секвенирования, при котором можно установить последовательность не более 1000 нуклеотидов, различные платформы NGS способны за один запуск определять от нескольких десятков тысяч до нескольких миллиардов нуклеотидов в зависимости от стоящих перед исследователем задач. Благодаря высокой производительности возможно тестирование сразу нескольких генетических заболеваний у нескольких десятков пациентов за одну реакцию секвенирования, что значительно снижает себестоимость проводимого анализа [15].
  3. Чувствительность. NGS технология позволяет находить мутации, представленные лишь в небольшой популяции клеток анализируемого биоматериала, что важно при дифференциальной диагностике раковых опухолей [16].

 Однако, технология NGS имеет и ряд недостатков. В первую очередь, это по-прежнему значительная стоимость оборудования и реагентов. Вследствие высокой производительности метода возникает проблема анализа данных, включающего оценку качества прочтения, поиска мутаций и полиморфных вариантов. Для решения этой проблемы необходимо создание программного обеспечения, позволяющего непосредственно врачу, не обладая знаниями в области биоинформатики, анализировать полученные результаты. Большой объем получаемых данных требует наличия сложной компьютерной инфраструктуры [17]. Эта проблема в первую очередь касается данных полногеномного секвенирования, и в меньшей степени – таргетного ресеквенирования. Помимо чисто технических задач, остаются вопросы по процедуре проведения валидации метода NGS для клинического применения. В разных странах соответствующие процедуры могут немного отличаться, однако к методикам, используемым в клинической лабораторной диагностике, повсеместно предъявляются значительно более строгие требования, чем к результатам научных исследований. Эти вопросы активно обсуждаются и появляются первые рекомендации по валидации NGS [18]. Использование решений на основе технологий NGS, как подтверждающего теста при неонатальном скрининге может значительно улучшить качество проводимых исследованиц, а также сократить время до постановки диагноза при использовании генетической диагностики уже на втором этапе скрининга среди пациентов с положительным или пограничным результатом первого этапа. В рамках проекта «Неонатальная NGS-генодиагностика», запущенного компанией Sequoia genetics ГК Алкор Био на основе технологии таргетного обогащения, была разработана панель для секвенирования кодирующих частей генов, отвечающих за развитие трех заболеваний, включенных в программу обязательного скрининга новорожденных в России: муковисцидоза, фенилкетонурии и галактоземии. Эти моногенные заболевания могут быть вызваны сотнями различных мутаций, что делает секвенирование целесообразным для их идентификации. В общей сложности в трех генах, связанных с развитием этих заболеваний, известно около трехсот мутаций, достоверно ассоциированных с развитием тяжелых фенотипических форм. Для повышения производительности и снижения себестоимости анализа была использована технология молекулярного баркодирования образцов, позволяющая проанализировать несколько десятков пациентов в одной постановке. Для облегчения процесса анализа разработано программное обеспечение для обработки и визуализации обнаруженных генетических вариантов. На данный момент технология проходит испытания на реальных образцах ДНК пациентов из российских коллекций и регистров. Завершением разработки будет являться верификация и валидация решения для применения в клинической практике. 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Благодаря постоянно снижающейся стоимости, высокой производительности, а также широким возможностям мультиплексирования по образцам, и тестируемым регионам, технология NGS в ближайшем будущем должна прийти на смену целому спектру методов ДНК-диагностики. В свою очередь, внедрение тестирования социально значимых моногенных наследственных заболеваний, включенных в программу обязательной неонатальной диагностики, методом таргетного ресеквенирования может значительно улучшить качество диагностики этих заболеваний и стать отправной точкой в процессе широкого внедрения технологии в клиническую лабораторную практику. 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Burgard P., Cornel M., Filippo F. Di et al. Report on the practices of newborn screening for rare disorders implemented in Member States of the European Union, Candidate, Potential Candidate and EFTA Countries. 2012.
  2. Therrell B., Lorey F., Eaton R. et al. Impact of Expanded Newborn Screening - United States, 2006. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2008; 57: 1012-1015.
  3. Marian A.J. Medical DNA sequencing. Curr Opin Cardiol. 2011; 26(3): 175-80.
  4. The Future of NGS Market Study. Cambridge Healthtech Institute. 2011.
  5. Metzker M.L. Sequencing technologies – the next generation. Nat. Rev. Genet. 2010; 11: 31–46.
  6. Gnirke A., Melnikov A., MacGuire J. et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted resequencing. Nat Biotech 2009; 27 (2): 182–189.
  7. Mamanova L., Coffey A.J., Scott C.E. et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat. Methods 2010; 7: 111–1118.
  8. Jones M.A., Bhide S., Chin E. et al. Targeted polymerase chain reaction-based enrichment and next generation sequencing for diagnostic testing of congenital disorders of glycosylation, Genet. Med. 2011; 13: 921–932.
  9. Hollants S., Redeker E.J., Matthijs G. Microfluidic amplification as a tool for massive parallel sequencing of the familial hypercholesterolemia genes. Clin. Chem. 2012; 58: 717–724.
  10. Clark M.J., Chen R., Lam H.Y. et al. Performance comparison of exome DNA sequencing technologies. Nat. Biotechnol. 2011; 29: 908–914.
  11. Casci T. DNA sequencing: exome sequencing technologies compared, Nat. Rev. Genet. 2011; 12: 741.
  12. Veltman J.A., Brunner H.G. De novo mutations in human genetic disease. Nat. Rev. Genet. 2012; 13: 565–575.
  13. Banerji S., Cibulskis K., Rangel-Escareno C. et al. Sequence analysis of mutations and translocations across breast cancer subtypes, Nature 2012; 486: 405–409.
  14. Cystic Fibrosis Mutation Database. http://www.genet.sickkids.on.ca/app
  15. Kingsmore S.F., Lantos J.D., Dinwiddie D.L. et al. Next-generation community genetics for low- and middle-income countries. Genome Medicine 2012; 4: 25.
  16. Desai A.N., Jere A. Next-generation sequencing: ready for the clinics? Clin Genet 2012; 81: 503–510.
  17. Baker M. Next-generation sequencing: adjusting to data overload. Nature Methods 2010; 7: 495-499.
  18. Ultra High Throughput Sequencing for Clinical Diagnostic Applications - Approaches to Assess Analytical Validity: Report from the Public Meeting (June 23, 2011).